في الموقع الكشف والتحديد الكمي خلية مفردة لجسيمات نانوية أكسيد المعدن باستخدام تحليل ميكروبروبي النووية

Summary

يصف لنا إجراء للكشف عن هذا الموقع في العناصر الكيميائية في الخلايا البشرية، فضلا عن تقديرها في المختبر . الطريقة مناسبة تماما لأي نوع من الخلايا ومفيد بشكل خاص للتحاليل الكيميائية الكمية في الخلايا المفردة التالية في المختبر أكسيد المعدن جسيمات نانوية التعرض.

Abstract

تمكين التقنيات التحليلية الدقيقة استناداً إلى تصوير عنصر كيميائي التعريب والتحديد الكمي للتركيب الكيميائي على المستوى الخلوي. أنها تتيح إمكانيات جديدة لتوصيف نظم المعيشة وهي مناسبة خاصة لكشف، وإضفاء الطابع المحلي والتحديد الكمي لوجود جسيمات نانوية أكسيد المعدن في العينات البيولوجية والبيئة على حد سواء. في الواقع، هذه التقنيات جميع المتطلبات ذات الصلة من حيث (ط) الحساسية (من 1 حتى 10 µg.g^-1 من وزن جاف)، (ثانيا) ميكرومتر نطاق القرار المكانية، والكشف عن (ثالثا) متعددة العناصر. ونظرا لهذه الخصائص، ميكروبيم تصوير عنصر كيميائي يمكن قوة تكمل تقنيات التصوير الروتينية مثل بصري والفحص المجهري الأسفار. ويصف هذا البروتوكول كيفية إجراء تحليل ميكروبروبي نووية في الخلايا المستزرعة (U2OS) تتعرض لجسيمات نانوية ثاني أكسيد التيتانيوم. يجب أن تنمو خلايا ويتعرض مباشرة في حامل مصممة خصيصا عينة المستخدمة في المجهر الضوئي وفي مراحل التحليل ميكروبروبي النووية. يحفظ تثبيت العينات المبردة يغرق-تجميد المنظمة الخلوية وتوزيع العناصر الكيميائية. تحليل ميكروبروبي النووية المتزامنة (أيون مجهر مسح وقياس الطيف الكتلي backscattering رذرفورد والجسيمات الناجمة عن انبعاث الأشعة السينية) أجريت على العينة يوفر معلومات حول الكثافة الخلوية، توزيع محلية العناصر الكيميائية، فضلا عن محتوى جسيمات نانوية الهاتف الخلوي. وهناك حاجة متزايدة لهذه الأدوات التحليلية داخل الأحياء، ولا سيما في سياق الناشئة من نانوتوكسيكولوجي والتي يجب تعميق قدرتنا على الفهم للتفاعلات بين الجسيمات النانوية والعينات البيولوجية لطب النانوي. على وجه الخصوص، كما لا تتطلب تحليل ميكروبروبي النووية جسيمات نانوية أن يكون المسمى، وفرة نانوحبيبات قابلة للقياس وصولاً إلى مستوى الخلية الفردية في عدد سكان خلية، صرف النظر عن حالتها السطحية.

Introduction

يتحدد التوازن الخلوية بمراقبة الامتصاص والاستيعاب، والتعريب داخل الخلايا لمختلف العناصر النزرة (أيونات، المعادن، والمركبات غير العضوية الخارجية). كثيرا ما تكون في شكل آثار هذه المكونات، ولكن مع ذلك قد يكون لها أثر كبير في الفسيولوجيا النظام. وهكذا، دراسة الكيمياء الحيوية في الخلية في الحالات العادية والمرضية/أكد مفتاح خطوة نحو فهم الآليات الأيضية الخلوية شاملة. ولذلك، يصبح من الضروري تطوير تقنيات التصوير والتحليل تمكن التحقيق من وفرة المواد الكيميائية داخل الخلايا، والهيكل التنظيمي ووظائفها الاستقلابية ذات الصلة. أساليب قليلة جداً قادرون على تقديم في الوضع الطبيعي كمية قطعة من المعلومات بشأن طبيعة المواد الكيميائية عموما لنموذج معين. وبصرف النظر عن أساليب تحليل العينات في شكل مجمع، النظر في الموقع تحليلات العينات البيولوجية في هذه التكاملية دون فقدان المعلومات الشامل والهيكلي، وبالتالي الحفاظ على هذه المواد الكيميائية المكونة لها (العناصر النزرة والايونات) و البروتينات. وعلاوة على ذلك، كما نانوسسينسيس مواصلة تطوير، تصوير محسنة والأساليب التحليلية للرصد البيئي على المستوى الخلوي ستكون اللازمة لمراقبة وقياس نانو-كائن السلوكيات والتفاعلات. ¹

وقد حددت جسيمات نانوية (NPs) ككائنات العارضة البعد الوجه واحد على الأقل في مجموعة 1 و 100 نانومتر. ² نظراً لخصائصها الفيزيائية خاصة، مصادر القدرة النووية تستخدم على نطاق واسع في الصناعة. وتستخدم مصادر القدرة النووية في التطبيقات الحيوية وفي لطب النانوي. ^{3 , 4} الخصائص الفيزيائية العديد من مصادر القدرة النووية، وعلى الرغم من أنها قد تولد بعض المخاطر من آثار ضارة على صحة الإنسان والبيئة. يمكن أن هذه المخاطر الناجمة عن التعرض لفترات طويلة ومتكررة على حد سواء التركيز على مختلف المستويات، وهذا قد لا بعد بوضوح. ^{5 , 6 , 7 , 8} على وجه الخصوص، مصير مصادر القدرة النووية داخل الخلايا والاستجابات الخلوية المرتبطة بها، حتى الآن، وصف غير كامل. وهذا جزئيا بسبب ندرة الأساليب التي تسمح الكشف والتحديد الكمي لمصادر القدرة النووية المدخلة في خلية واحدة. ⁹

إلى جانب الأدوات التحليلية الكلاسيكية المستخدمة لتقدير الجرعة الخلوية من جسيمات نانوية ميكروسكوبيس، الطيف الكتلي (مللي ثانية)، الحث البلازما مرض التصلب العصبي المتعدد (برنامج المقارنات الدولية-MS)^10،11 واللوني السائل مرض التصلب العصبي المتعدد (LC-مرض التصلب العصبي المتعدد)، ولكنها لا توفر سوى الحصول على معلومات مفيدة في نطاق العيانية. أيا منها لا يمكن أن توفر إجراء تقييم دقيق لمحتوى NPs سوبسيلولار ولا توزيع مصادر الطاقة النووية دون الاستخدام أساليب تجزئة. تقييم منهجي للاستجابة للجرعة وبالتالي مستحيل مع هذه الأساليب، بدلاً من الأساليب استناداً إلى التحليل الطيفي الذري مثل ميكروبروبي النووية تحليل^12،13، السنكروتروني الأشعة الفلورية مجهرية¹⁴ ، والثانوية أيون الطيف الكتلي (سيمز). ^{15 , 16} هذه الأساليب مثيرة للاهتمام خاصة كما أنها تكمل الملاحظات باستخدام مجهر الأسفار، ولا سيما عند مصادر القدرة النووية لا يمكن أن يكون المسمى مع جزيئات الفلورسنت وهكذا تدرس في دولته الأصلية. إلى حد ما، حتى عندما يتم المطعمة NPs مع فلوروفوريس، (ط) القياس الكمي لا تزال صعبة لأن مستوى العلامات الواحدة التي أرستها غير معروف ويجوز تعديل (ثانيا) تعديل المواد الكيميائية السطحية التي أرستها توزيعه الخلوية.

في هذه المقالة، نركز على أسلوب يقوم على مزيج من التقنيات النووية ميكروبروبي تهدف إلى تصوير مورفولوجيا وتكوين عنصري من العينات البيولوجية في الكبرى، ثانوية، وتتبع تركيزات.

تحليل ميكروبروبي النووية يثبت أن تكون ملائمة بصفة خاصة لقياس العناصر الكيميائية النزرة في الأنسجة البيولوجية. شعاع القرار الأفقي (0.3 إلى 1 ميكرومتر) وحساسية في الكشف عن العناصر الكيميائية (من 1 إلى 10 µg.g^-1 وزن جاف) هي أيضا مناسبة للدراسات على المستوى الخلوي. وتستند التقنيات النووية ميكروبروبي كشف الجسيمات (الفوتونات والإلكترونات والايونات) ينبعث بعد شعاع أيون (عادة قيد التشغيل في الطاقات مليون إلكترون فولط) تتفاعل مع الذرات الموجودة في العينة. التفاعلات التي تحدث في الخلايا بشكل رئيسي: 1) الإثارة/تاين الذرات متبوعاً انبعاث الفوتونات بعد الذرات العودة إلى حالتها الأساسية؛ و 2) نشر جزيئات واردة مما يؤدي إلى تغيير في الطاقة والاتجاه. القياس لتحديد اللووسثي الطاقة الجسيمات المنبعثة من ذرات تشارك في التفاعل. للقيام بتعيين العناصر، microbeam أيون هو مرارا وتكرارا الممسوحة ضوئياً على سطح العينة، كثيرا ما على مساحة حوالي 100 من 100 ميكرومتر² التي تحتوي على عدة خلايا. يتم الكشف عن الجسيمات المنبعثة واحتياجاتها من الطاقة يتم تسجيلها لكل موقف الحزم. الفرز من الجسيمات وفقا لموقف الحزم، وبالتالي تحديد هيكل المسؤولة عن انبعاث هذه الجزيئات هو هدف معالجة البيانات. هنا، نحن دقة وصف نهج قائم على الأسفار مجهرية وتحليل ميكروبروبي النووي للكشف عن، وكذلك قياس مصادر خارجية في جداول الخلوية والخلوية الفرعية، بغية التحقيق في آثار التفاعلات التي أرستها بالمعيشة نظم. ونحن خاصة تركز على الفرص التي يتيحها هذا الأسلوب من حيث الكمي في الموقع لثاني أكسيد التيتانيوم جسيمات نانوية (TiO₂ NPs) المجاميع على مستوى سوبسيلولار.

Protocol

1-نموذج إعداد حامل

1. عينة صاحب تصميم وإعداد
   1. تصنيع حامل عينة من الحفر مربع 5 x 5 مم في إطار نظرة خاطفة سميكة 1 ملم.
   2. تنظيف قبل الشطف مع الإيثانول 70% (v/v) وتبقى في لوحات عقيمة حتى جاهزة للاستخدام.
      ملاحظة. مطلوب حامل عينة مناسبة لزراعة الخلايا والتعامل مع الخلية. أنه يحتاج إلى أن تكون مصممة للخلية استزراع، الملاحظات في المختبر بالمجهر الضوئي، وتحليل ميكروبروبي النووية والتصوير. هذا الحامل مصنوع من الإطار نظرة خاطفة¹³.
2. نموذج إعداد حامل
   1. تحضير حل فورمفار بإذابة 1 ملغ مسحوق فورمفار في 100 مل كلوروفورم.
   2. تمتد رقائق البولي في إطار معدني حيث أن يعرض لا حظيرة.
   3. استخدام تلميح عقيمة لنشر الحل فورمفار حول الحفرة صاحب العينة.
   4. وضع حساسا صاحب العينة مع الغراء على إحباط البولي ممدد (مربع 5 x 5 مم).
   5. كرر التسلسل السابق لإعداد حامل عينة واحدة لكل تكرار.
      ملاحظة. فيلم البولي (PC) متوافق حيويا وسميكة ما يكفي ومقاومة لمختلف البروتوكولات والقيود التحليلية.
      تنبيه-كلوروفورم السامة. تجنب استنشاق، الابتلاع أو الاتصال مع الجلد. دائماً استخدم غطاء الأبخرة كيميائية يعمل بشكل سليم وعوامل التصفية المناسبة.
3. عينة حامل التعقيم
   1. مكان صاحب العينة المركبة في قارورة مخروطية الشكل مع 50 مل من الإيثانول 70% (v/v) في إطار التحريض على 180 لفة في الدقيقة و +37 درجة مئوية بين عشية وضحاها، استخدام حاضنة/المحرض.
   2. شطف صاحب عدة مرات بالماء المقطر المعقم.
   3. الهواء الجاف منهم في ظروف معقمة وتعرضها للأشعة فوق البنفسجية (مصباح مبيد للجراثيم من مقعد السلامة الأحيائية، الدرجة الثانية) لمدة 30 دقيقة على كل جانب.
   4. الاحتفاظ بالعينات في لوحات 12-جيدا العقيمة (عينة واحدة حامل كل بئر) حتى جاهزة للاستخدام.
      ملاحظة: ويمكن تخزين متعددة أصحاب العينة في درجة حرارة الغرفة في لوحات 12-جيدا عقيمة وجافة مختومة مع بارافيلم لعدة أيام.

2-نمو الخلايا في حامل العينة المناسبة.

تنبيه: يجب أن تنفذ البروتوكول في مقعد السلامة الأحيائية الاندفاق الصفحي (الفئة الثاني) لاستبعاد تلويث المجهرية. التعامل مع المضادات الحيوية (مثل البنسلين، ستربتوميسين) مع القفازات. احترام أفضل الممارسات عند مناولة المواد البيولوجية (خطوط الخلايا، الكائنات المعدلة وراثيا المستمدة من الخلايا البشرية).

الحرجة: يجب التحقق من خطوط الخلايا المستخدمة للتأكد من أنها غير المصابين مفطورة.

1. ترانسفيكت خط الخلية U2OS مع بلازميد تحمل ^17،روجفب مصفوفة^18،19 باستخدام أسلوب تعداء وفقا للبروتوكول التي حددتها الشركة المصنعة.
2. للتأكد من تعداء مع بلازميد-حمل بيوسينسور ومنع فقدان بلازميد، حدد والحفاظ على transfected خلايا متوسطة الثقافة المناسبة.
3. تصور transfected الخلايا بالأسفار الفحص المجهري للتأكد من تعداء حدث ولتأكيد التعبير عن الأسفار وعرض شبكة المتقدرية شبكي وانبوبي¹⁹.
   وقفه نقطة: يمكن تجميد الخلايا في النتروجين السائل لعدة سنوات.
4. استخدام السكان الخلية transfected من استزراع الخلايا في وسيلة مناسبة من أجل الحصول على خلية شبه المتلاقية السكان. تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية، 5% (v/v) CO₂ في أجواء مياه مشبعة.
5. خلايا البذور بتركيز، كما هي في التقاء 80% يوم التثبيت. عادة، يمكن أن يستخدم بتركيز الخلايا 500 كل ميليلتر. حصاد الخلايا باستخدام 400 ميليلتر التربسين-يدتا 0.25% (v/v)، وتبقى لمدة 3 دقائق في 37 درجة مئوية. إيقاف عمل التربسين مع 1 مل من الثقافة المتوسطة. بيليه الخلايا بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 230 × ز و + 4 درجة مئوية، ثم إزالة المادة طافية، وإضافة وحدة التخزين المطلوبة من جديد الثقافة المتوسطة.
   ملاحظة. البروتوكول قابلاً للتطبيق لجميع أنواع الهاتف الخلوي وتعتمد على حجم الخلية والخلية مضاعفة الوقت عدد الخلايا في المصنف.
   تنبيه: تجنب تعريض التربسين، والمضادات الحيوية، والمصل لدورات تجميد أذاب المتكررة. تبقى لهم العقيمة. تقسيم الحل الأسهم إلى مختبرين وتجميدها في −20 درجة مئوية. تخزين في مختبرين حتى تاريخ انتهاء الصلاحية. شطف بيليه الخلية بعناية من أجل إزالة تماما التربسين. آثار التربسين المتبقية سيتم تأخير وتقليل كفاءة الطلاء.
6. عد الخلايا وتؤدي تمييع مع الطازجة المتوسطة ثقافة كاملة أبقى على 37 درجة مئوية من أجل الحصول على تعليق خلية مع خلايا 500 كل ميليلتر.
   ملاحظة: تركيز خلية تعليق له لكي تلائم كدالة لنوع الخلية، من أجل لوحة قطره 40 ميليلتر.
7. لوحة قطره 40 ميليلتر في وسط إحباط البولي. بعناية بوضع العينة ح 2 في +37 درجة مئوية و 5% (v/v) CO₂ في أجواء مياه مشبعة.
   الحاسمة: حالما يتم وضع العينة في الحاضنة، الحد قدر الإمكان من أي حركة ميكانيكية لصالح مرفق خلية سريعة. وفقا لنوع الخلية، يمكن أن يكون من الضروري لاحتضان خلايا أطول من ح 2 لتحقيق الكفاءة المثلى في بلاتينج. تحقق أن الجو حاضنة جيدا مشبعة لمنع قطرات من التبخر.
8. تحقق من صحة الخلايا المرفقة جيدا على رقائق البولي مجهر ضوئي باستخدام. بلطف إضافة 2 مل متوسطة كاملة جديدة والحفاظ على ح 24.

3-جسيمات نانوية إعداد والتعرض

ملاحظة: نيون تعديل صبغ TiO₂ NPs صممت، وتوليفها، وتعديلها كيميائيا مع رباعي ميثيل والرودامين isothiocyanate (تريتك). ^{20 , 21} يسمح هذا التعديل السطحية نانوحبيبات الكشف والتعقب والتعريب في عين المكان و في سيلولو في الخلايا الحية سواء الثابتة أو في الكائنات الحية متعددة الخلايا. ^{12 , 13 , 18}

تنبيه: يجب التعامل مع المواد النانوية وجسيمات نانوية بعناية. تجنب استنشاق، الابتلاع أو الاتصال مع الجلد. لمنع نشر في الهواء، يتم الاحتفاظ بجسيمات نانوية في الحل (ماء عالي النقاوة).

1. إعداد تعليق 1 mg.mL^{1 TiO}₂ NPs في الماء عالي النقاوة. تفريق NPs₂ TiO استخدام نبضات مكثفة 1-مين سونيكيشن في الرايت (750 W، 20 كيلوهرتز، السعة: 30%) باستخدام مولد فائق صوت ومن ميكروبروبي مخروطية مخصصة.
2. تمييع TiO₂ NPs في تركيز المطلوبة على المديين المتوسط والثقافة بغية الحصول على وقف تعرض ل µg.cm 4² (تركيز النهائي). استبدال المتوسطة بحجم مناسب متوسطة NPs تحتوي على خلايا ومزيج بلطف لتوزيع متجانس TiO₂ NPs. تحضير الخلايا التحكم وبالمثل دون إضافة TiO₂ مصادر القدرة النووية.
3. احتضان سكان الخلية ح 24 في 37 درجة مئوية و 5% (v/v) CO₂ جو مياه مشبعة.

4-بارافورمالدهيد المجهري التثبيت والأسفار.

1. تعد حلاً جديدة من بارافورمالدهيد الحل (منهاج عمل بيجين، 4% w/v) مخزنة في "المخزن المؤقت للفوسفات المالحة" (PBS، درجة الحموضة 7.4).
   1. إذابة 4 جم مسحوق منهاج عمل بيجين في 100 مل من برنامج تلفزيوني. الحرارة الحل إلى 65 درجة مئوية بينما التحريك باستخدام مغناطيس ومحرض مغناطيسية في غطاء دخان. زيادة درجة الحموضة بإضافة "هيدروكسيد الصوديوم م" 1 قطره واحدة في كل مرة حتى مسح الحل. بارد الحل لدرجة حرارة الغرفة وضبط ال pH إلى 7.4. استخدم الحل الطازجة مباشرة أو الإبقاء على + 4 درجة مئوية وحماية من الضوء.
      ملاحظة: ويمكن استخدام قبل اعتماد منهاج عمل بيجين الحلول لكن إعداد منهاج عمل بيجين استمت يضمن نوعية التثبيت أفضل وحفظ العينات ثابت طويل الأجل.
      تنبيه: منهاج عمل بيجين السامة؛ تجنب استنشاق، الابتلاع أو الاتصال مع الجلد. دائماً استخدم غطاء الأبخرة كيميائية يعمل بشكل سليم وعوامل التصفية المناسبة.
2. مرة واحدة، قد انقضت فترة حضانة المرض، وإزالة مستنبت الخلية التي تحتوي على TiO₂ NPs. شطف سكان الخلية مرة واحدة مع الطازجة الثقافة المتوسطة ومرة مع برنامج تلفزيوني (2 مل). إزالة برنامج تلفزيوني، الشطف بسرعة مع قاسمة تقييمه الطازجة والباردة (4% w/v، + 4 درجة مئوية).
   1. إضافة منهاج عمل بيجين (2 مل، 4% w/v، + 4 درجة مئوية). احتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   2. إزالة منهاج عمل بيجين، وشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني (2 مل، 3 مرات، 5 دقيقة) تحت التحريض.
      وقفه نقطة: يمكن استخدام هذه ثابتة كيميائيا عينات لإجراء "يغرق-تجميد" بعد الأسفار التصوير (انتقل إلى الخطوة 5) أو يستخدم فقط للأسفار التصوير (انتقل إلى الخطوة 4، 3).
3. وصمة عار النواة مع هويشت³³³⁴² تفرخ الخلايا لمدة 10 دقائق في برنامج تلفزيوني. يستخدم هويخست³³³⁴² بتركيز نهائي 500 نانومتر. وبعد الاحتضان إزالة الحل وشطف مع برنامج تلفزيوني.
   تنبيه: هويشت³³³⁴² خلية بيرمينت وقد تكون سامة. تجنب الاتصال المباشر، واستخدام قفازات أثناء إعداد واستخدام هويشت³³³⁴².
   الحرجة: كفالة إعداد هويشت³³³⁴² تلطيخ الحل هو طازجة والاحتفاظ بها في ظروف معقمة.
4. عملية إصلاح العينات في الموقع والتصوير خلية مفردة باستخدام مجهر الأسفار (الشكل 1).

5-"يغرق-تجميد" التثبيت والجفاف

1. تحضير صفيحة نقل ألومنيوم بالتبريد فإنه في نيتروجين سائل. تخزين اللوحة إلى مربع مليئة بسائل النيتروجين والحفاظ على سطح لوحة أعلاه السائل في بخار النيتروجين البارد.
   ملاحظة: يمكن إجراء نقل لوحة لأية لوحة معدنية (هنا، يمكننا استخدام الألومنيوم) التي يمكن أن يبرد لدرجة حرارة النتروجين السائل، والتي يمكن أن تدخل قاعة عينة مجفف التجميد.
   الحاسمة: المربع ينبغي أن تظل مغلقة قدر الإمكان منعا لترسب بخار الماء على سطح لوحة الباردة. لا ينبغي أن يشملها العينة المخزنة على اللوحة خلال إعداد النتروجين السائل.
2. شطف خلايا مرة واحدة في المتوسط الثقافة وثم مرتين أكثر، بإيجاز، في المياه المعقمة وعالي النقاوة للحصول على التخلص من أي أثر للاملاح المتبقية خارج الخلية.
   الحاسمة: التأكد من أن وسائل الإعلام تعد طازجة والاحتفاظ بها في ظروف معقمة. حرارة جميع وسائل الإعلام في 37 درجة مئوية قبل استخدامها. يجب أن يكون الشطف قصيرة جداً (بضع ثوان) وإزالة فائض السائل على العينات في أسرع وقت ممكن.
3. يغرق-تجميد الخلايا في-150 درجة مئوية في سائل النيتروجين مبردة 2-ميثيلبوتاني خلال 30 ثانية ومكان لهم على الألومنيوم نقل اللوحة. تخزين العينات هنا أثناء إعداد جميع العينات الأخرى. عند عينات من جميع كريوفيكسيد، نقل جميع-مرة واحدة عن طريق وضع لوحة نقل في تجميد مجفف.
   الحاسمة: عملية كريوفيكسيشن عموما ينبغي إلا تستغرق أكثر من 20 دقيقة من أجل منع إجراء تعديلات هيكلية تظهر في العينات المخزنة مؤقتاً في المربع نقل.
4. فريزيدري العينات باستخدام التسلسل التالي: 1) أداء جفاف الأولية ح 12 إلى 24 (-99 درجة مئوية، 10^-3 [مبر]) في ضغط منخفض ودرجة حرارة منخفضة، ثم 2) تنفيذ مرحلة جفاف ثانوية لمالا يقل عن 24 ساعة، زيادة درجة الحرارة إلى لوحة + 40 درجة مئوية، مع إبقاء الضغط المنخفض (40 درجة مئوية، 10^-3 [مبر]).
   تنبيه: نيتروجين سائل بارد جداً ويمكن أن تسبب تلف العين أو قضمه الصقيع الشديد عند الاتصال. استخدام الحاويات أعلى مقاعد البدلاء تكييفها للنقل، وارتداء معدات السلامة (القفازات المبردة، وحماية العين والوجه).
   تنبيه: 2-ميثيلبوتاني سريعة الاشتعال للغاية. يمكن الوصول إلى ضارة تلوث الهواء بسرعة على التبخر من هذا المضمون في + 20 درجة مئوية. تجنب استنشاق، الابتلاع أو الاتصال مع الجلد. استخدام التنفس وحماية العين، وقفازات واقية. دائماً استخدم غطاء الأبخرة كيميائية يعمل بشكل سليم. قد تكون مخزنة في + 4 درجة مئوية.
   الحاسمة: استخدام حرارة مناسبة (-150 درجة مئوية) لرصد درجات الحرارة 2-ميثيلبوتاني أثناء الدورة "يغرق-تجميد". 2-ميثيلبوتاني يجب أن تبقى باردة في مرحلة سائل. نقل عينات كريوفيكسيد في الأجواء المحيطة قد يسبب الأضرار الخلوية بسبب ارتفاع درجة الحرارة أو بخار الماء التكثيف على سطح العينة. وبناء على ذلك، يجب أن يتم النقل أسرع وقت ممكن معقول (30 ثانية)
   وقفه نقطة: بعد كريوفيكسيشن، ويمكن تخزين العينات في درجة حرارة الغرفة لعدة أيام في ظروف معقمة وجافة (محمية من الغبار والرطوبة). بدقة التعامل مع العينات بالملقط الجميلة ووضعها في لوحة 12-جيدا عقيمة مختومة مع بارافيلم. يمكن استخدام ديسيككانت لتجف في الجو.

6-النووية ميكروبروبي التحليل

ملاحظة: تحليل ميكروبروبي النووية أجريت في خط ميكروبيم أيفيرا (تطبيقات إينتيرديسسيبلينايريس des فايسسو d'Ions en آكيتين ضمور) استخدام تقنيات تحليلية شعاع مكملة أيون "الجسيمات الناجمة عن انبعاث الأشعة السينية" (μ- بيكسي) والمسح مجهر أيون (μ-STIM). ويستند المرفق معجل جسيمات MV 3.5 تسليم الحزم الأيونية الخفيفة في نطاق الطاقة مليون إلكترون فولط. ^{22 , 23}

وقفه نقطة: أيفيرا هو منشأة شعاع أيون استضافته جامعة بوردو الذي يوفر وصول إلى الفرق الوطنية والدولية بعد التقييم العلمي للتجربة المقترحة.

1. جبل أصحاب عينة نظرة خاطفة على صفيحة أبيرتوريد باستخدام الشريط على الوجهين.
2. ضع لوحة دعم عينة في طائرة عمودية عمودي على اتجاه الشعاع.
3. إغلاق دائرة التحليل وفراغ قاعة التحليل.
4. المسح مجهر أيون (μ-STIM)
   ملاحظة: يتم استخدام STIM لتسجيل خرائط كثافة مساحية من الخلايا بعد تحويل فقدان الطاقة للكتلة الخلوية، الاستفادة من حقيقة أن فقدان الطاقة تتناسب مع كثافة مساحية عينة (معبراً عنه في µg.cm^-2).
   1. استخدام microbeam هليوم (أنه⁺) 2 مليون إلكترون فولط كتحقيق مع حجم في المستوى البؤري لحوالي 300 نانومتر في القطر وفي منخفض الطلاقة (2000 ions.s^-1). قياس الطاقة الأيونات المنقولة مع جهاز كشف سليكون مستو (كاشف نقطة، 25 مم²، 11 كيلوفولط الطاقة القرار @ 5.4 مليون إلكترون فولط)، وضعت وراء العينة في محور شعاع.
5. الجسيمات التي يسببها انبعاث الأشعة السينية (μ-بيكسي) والطيف باكسكاتيرينج روثرفورد (μ-RBS).
   ملاحظة: تقديم تحليلات بيكسي μ μ-RBS في التوزيع المكاني والتحديد الكمي للعناصر الكيميائية مع قرار ميكرومتر الفرعية.
   1. استخدام microbeam بروتون (ح⁺) 1.5 مليون إلكترون فولط (pA 50-150)، ركزت وصولاً إلى قطره 1 ميكرومتر والمسح الضوئي عبر الخلايا نفس الاهتمام التي رصدت من قبل STIM من 4 إلى 8 ساعات وحوالي 100 × 100 ميكرومتر².
   2. جمع المستحث بالأشعة السينية الفوتونات المنبعثة من الذرات الموجودة في العينة (أثقل من Na) من الاستبانة Si(Li) كاشف الحالة الصلبة (145 eV الطاقة القرار، @Mn-Kα) المتمركزة في 45 ° من محور الحزم الواردة. استخدام طاقة فوتون المكتشفة لتحديد طبيعة كثافة الأشعة السينية وبواعث (مثلاً Z عنصر) لتحديد تركيز العنصر.
   3. في نفس الوقت جمع البروتونات منتشرة في ظهره في درجة-135 مع جهاز كشف سليكون (كاشف المنضب جزئيا، 25 مم²، 11 كيلوفولط فوم @ 5.4 مليون إلكترون فولط) لقياس العدد الكلي للجزيئات الواردة وتطبيع كثافة الأشعة السينية.
      الحاسمة: يتم استخدام مجموعة من معايير المعايرة المعتمدة لتقدير تركيز الذري من أجل معايرة استجابة كاشف الأشعة السينية. مواد مرجعية عبارة عن مجموعة من أفلام الذري رقيقة المودعة في 6.3 ميكرومتر سميكة رقائق مايلر. تنبعث الأشعة السينية طاقات تتراوح بين 0.6 (لي، خط K) 20.2 كيلو إلكترون فولط (الصحة الإنجابية، ك خط).

7-بيانات التحليل

1. إعادة بناء خرائط عنصري الكيميائية باستخدام البرنامج المساعد ي رابطة المحامين الدولية إيماجيج. ²⁴
   ملاحظة: وضعت برامج مخصصة في شكل البرنامج المساعد إيماجيج لعملية تحليل البيانات الخام ميكروبروبي النووية. تتوافق مع البيانات الخام إلى قائمة أحداث الناجمة عن تفاعل شعاع الجسيمات مع الخلايا التي يتم تسجيلها جنبا إلى جنب مع موقف شعاع كتسلسل زمني.
   1. استخدام البرنامج المساعد إيبا-ي لفرز الأحداث وفقا للنوع: تنتقل الطاقة أيون (STIM)، المستطار أيون الطاقة (RBS) أو طاقة فوتون الأشعة السينية (بيكسي). ثم، عملية بشكل منفصل كل نوع من أنواع البيانات.
   2. حساب خريطة كثافة المنطقة STIM
   3. حساب متوسط أطياف الطاقة فوتون الأشعة السينية، وتعريف لكل عنصر كيميائي من اهتمام إطار الطاقة من أجل استرداد عنصر التوزيع المكاني.
   4. تحديد المناطق ذات الاهتمام (ROI) (مثل الخلايا الفردية، بنية كثيفة، والمجاميع، إلخ.) وحساب أطياف الأشعة السينية المقابلة.
2. تحليل الأطياف RBS المناظرة من أجل حساب العدد الكلي للجزيئات الحادث²⁵.
3. تناسب أطياف الأشعة السينية باستخدام البرمجيات جاب²⁶ بغية تحديد تركيز عنصر لكل عائد الاستثمار.
   ملاحظة: حد نموذجي للكشف (اللد) للأسلوب في µg.g 1 إلى 10 نطاق^-1 في الكتلة الجافة اعتماداً على العدد الذري للعناصر (اللد يتناقص مع Z).

النتائج

خلية ثقافة وتصوير الأسفار المسماة فلوريسسينتلي TiO ₂ مصادر القدرة النووية

لقد قمنا بتصميم حامل عينة تكييفها لزراعة الخلايا والتعامل مع الخلية، فضلا عن التحليل المتعدد الوسائط. على وجه التحديد، من المهم أ?...

Discussion

يصف لنا طريقة توفير معلومات مفيدة تتجاوز ما هو ممكن مع تقنيات التصوير الأخرى، لا سيما على مستوى سوبسيلولار. بالإضافة إلى قدرتها التصوير، يقدم التحليل ميكروبروبي النووية أيضا إمكانيات للتحديد الكمي للعناصر الكيميائية التي تدخل في تكوين عينة بيولوجية. في هذا العمل، نحن درس السكان الخلايا ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture
U2OS	ATCC, LGC STANDARDS	ATCC HTB-96
Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine	Dominique DUTSCHER	L0211-500
FBS 500 mL	Dominique DUTSCHER	500105U
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher Scientific	11548876
L-Glutamine 200 mM, 100 mL	Invitrogen	25030024
Geneticin,  20 mL	ThermoFisher Scientific	10092772
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v)  500 mL	ThermoFisher Scientific	11570626
Viromer Red	Lipocalyx	VR-01LB-01
Matrix-roGFP Plasmid	AddGene	#49437
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H3570	Handle with care
NPs preparation
TiO2 P25 AEROXIDE	Degussa/Evonik
Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC)	SIGMA-ALDRICH	T3163	Surface modification of NPs
Sample preparation
Polycarbonate foil	Goodfellow	CT301020
Polyether Ether Ketone support (PEEK)	Matechplast	A-239-4047
Ethanol, ACS absolute	SIGMA-ALDRICH	02860-6x1L
Chlorform, Anhydrous, 99%	SIGMA-ALDRICH	372978-1L	Caution toxic
Formvar 100 g	Agar Scientific	AGR1201	Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform
NaOH	SIGMA-ALDRICH	S5881-500G
Sample fixation
Powder, 95% Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	158127-500G	Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS
PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+)	ThermoFisher Scientific	11503387
Prolong Gold Antifade Reagent	ThermoFisher Scientific	P36934
Triton X-100	SIGMA-ALDRICH	93443	Harmful
Sample cryofixation
Liquid nitrogen	air liquids sante		Harmful
Methylbutane >=99%	SIGMA-ALDRICH	M32631-1L	Caution toxic
Aluminium transfer plate	Home-made
Distilled and deionized water	Home-made		Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system
Parafilm	VWR	52858-000
Equipment
Barnstead Smart2Pure	ThermoFisher Scientific	50129870
Biosafety bench, class II	ThermoFisher Scientific	MSC-Advantage
TC20 automated cell counter	Biorad	145-0102SP
Counting slides 2 wells	Biorad	1450016
PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV	Canberra	PD25-12-100AM
High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα	Oxford Instruments
Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED)	Orsay Physics	1-SED
XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl	Micromatter	34381
XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2	Micromatter	34382
XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal	Micromatter	34383
XRF Calibration Standard Silicon as SiO	Micromatter	34384
XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx	Micromatter	34385
XRF Calibration Standard Calcium as CaF2	Micromatter	34387
XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal	Micromatter	34388
XRF Calibration Standard Iron as Fe metal	Micromatter	34389
Sonicator 750W	Sonics Materials	11743619
3MM microprobe	Bioblock scientific	220-05
Lyophilizer in vacuum	Elexience	EK3147
Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	431006-9901
Motorized stage xy	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	432031-9902
EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	420351-9910
Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	420781-9910
Zeiss filterset 02	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	488002-9901
Zeiss filterset 38HE	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	489038-9901
Zeiss filterset 31	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	000000-1031-350
Chemical fume hood	Erlab	Captair SD321
Particle accelerator	HVEE	singletron
Software
ImageJ software	National Institutes of health, USA	ImageJ 1.51
SimNRA software	Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany	SIMNRA 6.06
Gupix software	Guelph university, Canada	GUPIXWIN 2.2.4