JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Biology

تحليل الخلايا السطحية التصاق إعادة عرض في الاستجابة للتوتر الميكانيكية باستخدام الخرز المغناطيسي

Published: March 8th, 2017

DOI:

10.3791/55330

1Institute for Advanced Biosciences, Centre de recherche UGA - INSERM U1209 - CNRS UMR
* These authors contributed equally

التصاقات سطح الخلية هي المركزية في mechanotransduction، كما نقل التوتر الميكانيكية والشروع في مسارات الإشارات المشاركة في توازن الأنسجة والتنمية. هنا، نقدم بروتوكول لتشريح المسارات البيوكيميائية التي يتم تفعيلها في فعل للتوتر، وذلك باستخدام ميكروبيدات المغناطيسي المغلفة يجند وتطبيق قوة لمستقبلات الالتصاق.

المجمعات التصاق سطح الخلية Mechanosensitive يسمح للخلايا لاستشعار الخصائص الميكانيكية للمحيطهم. وقد حددت الدراسات الحديثة على حد سواء جزيئات الاستشعار القوة في مواقع الالتصاق، وعوامل النسخ التي تعتمد على القوة التي تنظم التعبير الجيني النسب المحددة ودفع مخرجات المظهرية. ومع ذلك، ظلت شبكات الإشارات تحويل التوتر الميكانيكية في الممرات الحيوية بعيد المنال. لاستكشاف مسارات الإشارات تعمل على التوتر الميكانيكية المطبقة على مستقبلات سطح الخلية، ميكروبيدات مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic يمكن استخدامها. هنا نقدم بروتوكول لاستخدام حبات مغناطيسية لتطبيق قوى للبروتينات التصاق سطح الخلية. باستخدام هذا النهج، فمن الممكن للتحقيق ليس فقط مسارات الإشارات هيولي التي تعتمد على القوة من قبل النهج البيوكيميائية المختلفة، ولكن أيضا إعادة عرض التصاق بواسطة العزلة المغناطيسية المجمعات الالتصاق تعلق حبات المغلفة يجند. ويشمل هذا البروتوكول إعداد يجند المشتركATED الخرز مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic، وتطبيق تحدد قوات الشد تليها التحليلات الكيميائية الحيوية. بالإضافة إلى ذلك، ونحن نقدم عينة تمثيلية من البيانات مما يدل على أن التوتر تطبيقها على التصاق القائم على إنتغرين مشغلات التصاق إعادة عرض ويغير البروتين التيروزين الفسفرة.

في metazoa والتوتر الميكانيكية يوجه تطوير الأنسجة والتوازن خلال تنظيم عدد لا يحصى من عمليات الخلوية مثل انتشار الأسلحة النووية، والتمايز والبقاء على قيد الحياة 1 و 2. التوتر الميكانيكية يمكن أن تنشأ من المصفوفة خارج الخلية أو يمكن أن تتولد من قبل الخلايا الملتصقة، التي عينة بيئة خارج الخلية من خلال آلية مقلص أكتوميوزين التي تشد على المصفوفة خارج الخلية و المسابير صلابة من خلال جزيئات والتوتر الحساسة. وردا على التوتر والبروتينات التصاق mechanosensitive تخضع التغييرات متعلق بتكوين التي تؤدي شلالات الإشارات المعقدة. في المقابل، هذه المسارات يشير تنسق mechanoresponse تشمل ا....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. يجند الإقتران إلى الخرز المغناطيسي

ملاحظة: يتم تنفيذ اقتران يجند باستخدام الخرز تفعيلها tosyl مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic مع 2.8 ميكرون قطر (تركيز الأسهم حل 10 8 حبات / مل، 30 ملغم حبات / مل). ويستند البروتوكول التالية على عينا?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويتضح التخطيطي للتقنية في الشكل 1A. بعد اقتران يجند، يتم تحضين حبات مغناطيسية مع الخلايا لمدة 20 دقيقة، ثم يستخدم المغناطيس الدائم لتطبيق قوى الشد من حوالي 30-40 السندات الإذنية لكمية مختلفة من الزمن. ويبين الشكل 1B 2.8 ميكرون الخرز المغناطيسي المغلفة FN-ب.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الطريقة الموصوفة هنا يشكل نهجا واضحة لتطبيق التوتر لمستقبلات الالتصاق سطح الخلية والسماح تنقية لاحقا. ومع ذلك، بعض الخطوات الهامة لأداء كفاءة تنقية التصاق وتحسين محتمل يمكن أن يتم اعتمادا على المستقبلات التصاق المستهدفة. نقدم المشاكل المحتملة التي قد يواجهها المس?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويدعم الفريق الاستشاري من المنح المقدمة من الوكالة الوطنية للبحوث (وكالة الاستخبارات الوطنية-13-JSV1-0008)، من البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (ماري كوري التكامل الوظيفي n˚8304162) ومن مجلس الأبحاث الأوروبي (ERC) تحت الأفق الاتحاد الأوروبي 2020 البحوث والابتكار برنامج (ERC ابتداء غرانت n˚639300).

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish)K&J Magnetics, IncDX88-N52grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick
Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish)K&J Magnetics, IncD84PC-BLKgrade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated 
Dynabeads M280 TosylactivatedThermofisher14203superparamagnetic beads 
DynaMag-2 MagnetThermofisher12321D
Fibronectin Sigma-AldrichF1141-5MGFibronectin from bovine plasma
Poly-D-LysineSigma-AldrichP7280-5MG
Apo-TransferrinSigma-AldrichT1428-50MGBovine Apo-Transferrin
Bovine serum albuminSigma-AldrichA7906-500G
DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate Life Technologies31966-021DMEM+GlutaMAX-I 500 ml 
60*15 mm culture dishFalcon353004

  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. . Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  2. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (5), 308-319 (2011).
  3. Guilluy, C., et al. The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins. Nat Cell Biol. 13 (6), 722-727 (2011).
  4. Matthews, B. D., Overby, D. R., Mannix, R., Ingber, D. E. Cellular adaptation to mechanical stress: role of integrins, Rho, cytoskeletal tension and mechanosensitive ion channels. J Cell Sci. 119 (3), 508-518 (2006).
  5. Zhao, X. -. H., et al. Force activates smooth muscle alpha-actin promoter activity through the Rho signaling pathway. J Cell Sci. 120 (Pt 10), 1801-1809 (2007).
  6. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  7. Austen, K., Kluger, C., Freikamp, A., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. Generation and analysis of biosensors to measure mechanical forces within cells. Meth Mol Biol. 1066, 169-184 (2013).
  8. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  9. Pelham, R. J., Wang, Y. l. . Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci USA. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  10. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  11. Chaudhuri, O., Parekh, S. H., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Combined atomic force microscopy and side-view optical imaging for mechanical studies of cells. Nat Meth. 6 (5), 383-387 (2009).
  12. Bays, J. L., et al. Vinculin phosphorylation differentially regulates mechanotransduction at cell-cell and cell-matrix adhesions. J Cell Biol. 205 (2), 251-263 (2014).
  13. Collins, C., et al. Localized tensional forces on PECAM-1 elicit a global mechanotransduction response via the integrin-RhoA pathway. Curr Biol. 22 (22), 2087-2094 (2012).
  14. Gordon, W. R., et al. Mechanical Allostery: Evidence for a Force Requirement in the Proteolytic Activation of Notch. Dev Cell. 33 (6), 729-736 (2015).
  15. Lessey-Morillon, E. C., et al. The RhoA guanine nucleotide exchange factor, LARG, mediates ICAM-1-dependent mechanotransduction in endothelial cells to stimulate transendothelial migration. J Immunol. 192 (7), 3390-3398 (2014).
  16. Osborne, L. D., et al. TGF-β regulates LARG and GEF-H1 during EMT to affect stiffening response to force and cell invasion. Mol Biol Cell. 25 (22), 3528-3540 (2014).
  17. Scott, D. W., Tolbert, C. E., Burridge, K. Tension on JAM-A activates RhoA via GEF-H1 and p115 RhoGEF. Mol Biol Cell. 27 (9), 1420-1430 (2016).
  18. Glogauer, M., Ferrier, J., McCulloch, C. A. Magnetic fields applied to collagen-coated ferric oxide beads induce stretch-activated Ca2+ flux in fibroblasts. Am J Physiol - Cell Physiol. 269 (5), C1093-C1104 (1995).
  19. Glogauer, M., et al. Calcium ions and tyrosine phosphorylation interact coordinately with actin to regulate cytoprotective responses to stretching. J Cell Sci. 110 (Pt 1), 11-21 (1997).
  20. Kuo, J. -. C., Han, X., Hsiao, C. -. T., Yates, J. R., Waterman, C. M. Analysis of the myosin-II-responsive focal adhesion proteome reveals a role for β-Pix in negative regulation of focal adhesion maturation. Nat Cell Biol. 13 (4), 383-393 (2011).
  21. Schiller, H. B., et al. β1- and αv-class integrins cooperate to regulate myosin II during rigidity sensing of fibronectin-based microenvironments. Nat Cell Biol. 15 (6), 625-636 (2013).
  22. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nat Cell Biol. 16 (4), 376-381 (2014).
  23. Plopper, G. E., McNamee, H. P., Dike, L. E., Bojanowski, K., Ingber, D. E. Convergence of integrin and growth factor receptor signaling pathways within the focal adhesion complex. Mol Biol Cell. 6 (10), 1349-1365 (1995).
  24. Roca-Cusachs, P., Gauthier, N. C., Del Rio, ., A, M. P., Sheetz, Clustering of alpha(5)beta(1) integrins determines adhesion strength whereas alpha(v)beta(3) and talin enable mechanotransduction. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (38), 16245-16250 (2009).
  25. Ajeian, J. N., et al. Proteomic analysis of integrin-associated complexes from mesenchymal stem cells. Proteomics Clin Appl. 10 (1), 51-57 (2016).
  26. Horton, E. R., Astudillo, P., Humphries, M. J., Humphries, J. D. Mechanosensitivity of integrin adhesion complexes: Role of the consensus adhesome. Exp Cell Res. , (2015).
  27. Jones, M. C., et al. Isolation of integrin-based adhesion complexes. Curr Protoc Cell Biol. 66, 9.8.1-9.8.15 (2015).
  28. Ng, D. H. J., Humphries, J. D., Byron, A., Millon-Frémillon, A., Humphries, M. J. Microtubule-dependent modulation of adhesion complex composition. PloS One. 9 (12), e115213 (2014).
  29. Byron, A., Humphries, J. D., Bass, M. D., Knight, D., Humphries, M. J. Proteomic analysis of integrin adhesion complexes. Sci Sign. 4 (167), pt2 (2011).
  30. Byron, A., Humphries, J. D., Craig, S. E., Knight, D., Humphries, M. J. Proteomic analysis of α4β1 integrin adhesion complexes reveals α-subunit-dependent protein recruitment. Proteomics. 12 (13), 2107-2114 (2012).
  31. Marjoram, R. J., Guilluy, C., Burridge, K. Using magnets and magnetic beads to dissect signaling pathways activated by mechanical tension applied to cells. Methods. , (2015).
  32. Pasapera, A. M., Schneider, I. C., Rericha, E., Schlaepfer, D. D., Waterman, C. M. Myosin II activity regulates vinculin recruitment to focal adhesions through FAK-mediated paxillin phosphorylation. J Cell Biol. 188 (6), 877-890 (2010).
  33. Sawada, Y., Sheetz, M. P. Force transduction by Triton cytoskeletons. J Cell Biol. 156 (4), 609-615 (2002).
  34. Grinnell, F., Geiger, B. Interaction of fibronectin-coated beads with attached and spread fibroblasts. Binding, phagocytosis, and cytoskeletal reorganization. Exp Cell Res. 162 (2), 449-461 (1986).
  35. Schroeder, F., Kinden, D. A. Measurement of phagocytosis using fluorescent latex beads. J Biochem Biophys Meth. 8 (1), 15-27 (1983).
  36. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
  37. Seo, D., et al. A Mechanogenetic Toolkit for Interrogating Cell Signaling in Space and Time. Cell. 165 (6), 1507-1518 (2016).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved