Analyse Cell Surface Vedhæftning Remodeling i Reaktion på Mekanisk Tension Brug magnetiske perler

Cell overflade sammenvoksninger er centrale i mechanotransduction, da de sender mekanisk spænding og indlede signalveje involveret i vævshomeostase og udvikling. Her præsenterer vi en protokol for at dissekere de biokemiske veje, der aktiveres som reaktion på spænding, ved hjælp af ligand-overtrukne magnetiske mikrokugler og force ansøgning til vedhæftning receptorer.

Mekanosensitive celleoverflade adhæsionskomplekser tillader celler at fornemme de mekaniske egenskaber af deres omgivelser. Nylige undersøgelser har identificeret både kraft-sensing molekyler ved vedhæftning sites, og kraft-afhængige transkriptionsfaktorer, der regulerer slægt-specifikke genekspression og drive fænotypiske udgange. Imidlertid har de signalering netværk konvertere mekanisk spænding i biokemiske veje været undvigende. At udforske de signalveje beskæftiget ved mekanisk spænding påføres celleoverfladereceptor, kan superparamagnetiske mikroperler anvendes. Her præsenterer vi en protokol til at bruge magnetiske perler til at anvende styrker til celleoverfladen adhæsionsproteiner. Ved anvendelse af denne fremgangsmåde, er det muligt at undersøge ikke eneste kraft-afhængig cytoplasmatisk signalveje fra forskellige biokemiske metoder, men også adhæsion remodellering ved magnetisk isolering af adhæsionskomplekser knyttet til ligand-coatede perler. Denne protokol omfatter udarbejdelse af ligand-coerede superparamagnetiske perler og anvendelse af definere trækkræfter efterfulgt af biokemiske analyser. Derudover tilbyder vi et repræsentativt udsnit af data, der viser, at spændingen anvendes på integrin-baserede vedhæftning udløser vedhæftning remodellering og ændrer proteintyrosinphosphorylering.

I Metazoa, mekanisk spænding dirigerer væv udvikling og homeostase gennem regulering af et utal af cellulære processer såsom proliferation, differentiering og overlevelse ^{1, 2.} Mekaniske spænding kan opstå fra den ekstracellulære matrix eller kan genereres ved adhærente celler, som prøven deres ekstracellulære miljø gennem actomyosin kontraktile maskiner, der trækker på ekstracellulær matrix og prober sin stivhed gennem spændinger følsomme molekyler. Som reaktion på spænding, mekanosensitive adhæsionsproteiner undergå konformationsændringer der udløser komplekse signalleringskaskader. Til gengæld er disse sig....

1. Ligand Konjugering til magnetiske perler

Bemærk: Ligand konjugation udføres ved anvendelse superparamagnetiske tosyl--aktiverede perler med en 2,8 um diameter (stamopløsning koncentration 10 ⁸ perler / ml, 30 mg perler / ml). Den følgende protokol er baseret på prøver af ca. 2 x 10 ⁵ celler, som svarer til MRC-5-celler dyrket til 80% konfluens i en 60 mm vævskulturplade. Juster lydstyrken af ​​perler og reagenser i overensstemmelse hermed, hvis du bruger pla.......

Den skematiske af teknikken er vist i figur 1a. Efter ligand konjugering, er magnetiske perler inkuberes med celler i 20 minutter, og derefter anvendes en permanent magnet til at anvende trækkræfter på ca. 30-40 pN for forskellige tidsrum. Figur 1b viser 2,8 um FN-belagte magnetiske kugler bundet til MRC5 celleadhæsionsreceptorer.

Vasketrinnene af superparamagnetiske perler efter cellelysis er afgørende og bestemme graden af ​​oprensning. Mindst tre.......

Den her beskrevne fremgangsmåde er en enkel tilgang til at anvende spænding til celleoverflade adhæsionsreceptorer og tillade deres efterfølgende oprensning. Men nogle trin er afgørende for at udføre en effektiv vedhæftning rensning og potentiel optimering kan gøres afhængig af de målrettede adhæsionsreceptorer. Vi præsenterer potentielle problemer brugeren kan støde nedenfor.

Vi anvendte 2,8 um diameter magnetiske perler, men større perler kan anvendes, såsom 4,5 um diameter........

CG er støttet af tilskud fra Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-JSV1-0008), fra EU syvende rammeprogram (Marie Curie Career Integration n˚8304162) og fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EU 's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram (ERC Starting Grant n˚639300).