Het analyseren van de celoppervlakadhesie remodeling in reactie op mechanische spanning met behulp van Magnetic Beads

Celoppervlak verklevingen staan ​​centraal in mechanotransductie, omdat ze mechanische spanning verzenden en inleiding van de signaalwegen die betrokken zijn in het weefsel homeostase en ontwikkeling. Hier presenteren we een protocol voor het ontleden van de biochemische routes die worden geactiveerd in reactie op de spanning, onder toepassing van ligand beklede magnetische microkralen en krachtuitoefening adhesie receptoren.

Mechanosensitieve celoppervlak adhesie complexen laat cellen om de mechanische eigenschappen van hun omgeving detecteren. Recente studies hebben zowel force sensing moleculen aan adhesieplaatsen en kracht-afhankelijke transcriptiefactoren die lijn genexpressie reguleren en rijden fenotypische uitkomsten van. Echter, de signalering netwerken omzetten van mechanische spanning in biochemische routes bleef ongrijpbaar. Om de signaalwegen betrokken bij mechanische spanning aangebracht op het celoppervlak receptor te verkennen, kan superparamagnetische microkralen worden gebruikt. Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van magnetische korrels krachten toepassing celoppervlak adhesie-eiwitten. Met deze aanpak kan men niet alleen kracht-afhankelijke cytoplasmatische signaleringsroutes door verschillende biochemische benaderingen, maar ook adhesie remodellering onderzoeken door magnetische isolatie van adhesie complexen aan de ligand-gecoate kralen. Dit protocol omvat de bereiding van ligand-coated superparamagnetische delen en de toepassing van vast trekkrachten gevolgd door biochemische analyses. Daarnaast bieden wij een representatieve steekproef van gegevens die aantonen dat de spanning toegepast op-integrine gebaseerde adhesie triggers hechting renovatie en verandert eiwittyrosinefosforylatie.

In metazoen, mechanische spanning regisseert weefsel ontwikkeling en homeostase door middel van de regulering van een groot aantal cellulaire processen zoals proliferatie, differentiatie en overleving ^{1, 2.} Mechanische spanning kan ontstaan ​​uit de extracellulaire matrix of kunnen worden gegenereerd door hechtende cellen, welk monster de extracellulaire omgeving via actomyosine contractiele machinerie die trekt op extracellulaire matrix en sondes zijn stijfheid met spanningsgevoelige moleculen. In reactie op spanning mechanosensitieve adhesieproteïnen ondergaan conformationele veranderingen die complexe sign....

1. Ligand Conjugatie naar Magnetic Beads

Opmerking: Ligand conjugatie wordt uitgevoerd met behulp superparamagnetische-tosyl geactiveerde kralen met een diameter 2,8 urn (voorraadoplossing concentratie 10 ⁸ kralen / ml, 30 mg kralen / ml). Het volgende protocol is gebaseerd op monsters van ongeveer 2 x 10 ⁵ cellen, die overeenkomen met MRC-5-cellen gekweekt tot 80% confluentie in een 60 mm weefselkweekplaat. Pas het volume van kralen en reagentia dienovereenkomstig bij ge.......

Het schema van de techniek wordt geïllustreerd in figuur 1a. Na conjugatie ligand, worden magnetische korrels geïncubeerd met cellen gedurende 20 min, en daarna een permanente magneet wordt gebruikt om trekkrachten toepassing van ongeveer 30-40 pN van verschillende tijdsduur. Figuur 1b toont 2,8 um FN-beklede magnetische korrels gebonden aan MRC5 celadhesie receptoren.

De wasstappen van superparamagnetische na cellysis zijn van cruciaal belang en bepalen d.......

De hier beschreven methode is een eenvoudige benadering van spanning celoppervlak adhesie receptoren brengen en laten hun daaropvolgende zuivering. Sommige stappen zijn essentieel voeren efficiënte hechting zuivering en mogelijke optimalisatie kan afhankelijk van de beoogde hechting receptoren. We presenteren potentiële problemen kan de gebruiker hieronder tegenkomen.

We gebruikten 2,8 urn diameter magnetische korrels maar grotere kralen kunnen worden gebruikt, zoals 4,5 pm diameter. Toch .......

CG wordt ondersteund door subsidies van het Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-JSV1-0008), uit de Europese Unie Zevende Kaderprogramma (Marie Curie Career Integration n˚8304162), en van European Research Council (ERC) in het kader van Horizon van de Europese Unie 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma (ERC Starting Grant n˚639300).