Analyse de surface cellulaire Adhérence remodelage en réponse à la tension mécanique utilisant des billes magnétiques

adhérences de surface cellulaire sont au cœur de la mécanotransduction, car ils transmettent une tension mécanique et d'initier les voies de signalisation impliquées dans l'homéostasie et le développement des tissus. Ici, nous présentons un protocole pour disséquer les voies biochimiques qui sont activés en réponse à une tension, en utilisant des microbilles magnétiques revêtues de ligand et l'application de la force sur les récepteurs d'adhérence.

complexes d'adhésion de la surface cellulaire mécanosensibles permettent aux cellules pour détecter les propriétés mécaniques de leur environnement. Des études récentes ont identifié deux molécules de détection de force sur les sites d'adhésion, et les facteurs de transcription de force dépendante qui régulent l'expression des gènes spécifiques à la lignée et conduisent les sorties phénotypiques. Cependant, les réseaux de signalisation de conversion tension mécanique dans les voies biochimiques sont restées insaisissables. Pour explorer les voies de signalisation engagées sur une tension mécanique appliquée à un récepteur de surface cellulaire, les microbilles superparamagnétiques peuvent être utilisés. Ici, nous présentons un protocole utilisant des billes magnétiques pour appliquer des forces à des protéines d'adhésion de surface cellulaire. En utilisant cette approche, il est possible d'étudier non seulement la force dépendant de signalisation cytoplasmique voies par diverses approches biochimiques, mais aussi l'adhérence remodelage par l'isolement magnétique de complexes d'adhésion fixés aux billes de ligand revêtu. Ce protocole comprend la préparation du ligand-coperles superparamagnétiques és, et l'application de définir les forces de traction suivie par des analyses biochimiques. En outre, nous fournissons un échantillon représentatif de données démontrant que la tension appliquée à l'adhésion sur la base intégrine déclenche l'adhérence remodelage et altère la protéine tyrosine phosphorylation.

En métazoaires, la tension mécanique dirige le développement des tissus et de l' homéostasie grâce à la réglementation d'une myriade de processus cellulaires tels que la prolifération, la différenciation et la survie ^{1, 2.} la tension mécanique peut provenir de la matrice extracellulaire, ou peut être produite par des cellules adhérentes, ce qui leur échantillon de l'environnement extracellulaire par l'appareil contractile actomyosine qui tire sur la matrice extracellulaire et les sondes grâce à sa rigidité des molécules de tension sensible. En réponse à la tension, les protéines d'adhésion....

1. Ligand Conjugaison à des billes magnétiques

Remarque: la conjugaison Ligand est réalisée en utilisant des billes de tosyle activé superparamagnétiques avec un 2,8 um de diamètre (concentration stock solution 10 ⁸ billes / mL, 30 mg de billes / mL). Le protocole suivant est basé sur des échantillons d'environ 2 x 10 ⁵ cellules, qui correspondent à des cellules MRC-5 cultivées jusqu'à 80% de confluence dans une plaque de culture tissulaire de 60 mm. R.......

Le schéma de la technique est illustrée sur la figure 1a. Suite à la conjugaison du ligand, les billes magnétiques sont mises en incubation avec les cellules pendant 20 min, puis un aimant permanent est utilisé pour appliquer des forces de traction d'environ 30 à 40 pN pour différents laps de temps. La figure 1b représente 2,8 um billes magnétiques revêtues de FN MRC5 liés à des récepteurs d'adhésion cellulaire.

Les étapes de lavage de.......

La méthode décrite ici constitue une approche simple pour appliquer une tension à des récepteurs d'adhésion de la surface cellulaire et permettent leur purification ultérieure. Cependant, certaines étapes sont essentielles pour effectuer efficacement la purification de l'adhérence et l'optimisation potentielle peut être fait en fonction des récepteurs d'adhésion ciblés. Nous présentons les problèmes potentiels que l'utilisateur peut rencontrer ci-dessous.

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