Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
הידבקויות פני התא הם מרכזי mechanotransduction, כפי שהם לשדר מתח מכני ליזום את מסלולי איתות מעורבים הומאוסטזיס ופיתוח רקמות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתח את התהליכים הביוכימיים אשר מופעלים בתגובה מתח, באמצעות microbeads מגנטי מצופה ליגנד ויישום כוח לקולטנים הידבקות.
מתחמי הידבקות תא משטח Mechanosensitive לאפשר לתאים לחוש את התכונות המכאניות של סביבתם. מחקרים שנעשה לאחרונה זיהו הם מולקולות חישת כוח באתרים דבקים, ואת גורמי תעתוק תלוי כוח המווסתים ביטוי גנים ספציפי שושלת ולנסוע פלטי פנוטיפי. עם זאת, רשתות איתות המרת מתח מכאני לתוך הביוכימיים נותרו חמקמקות. כדי לחקור את מסלולי האיתות עוסקים על מתח מכאני להחיל פני תא קולטן, microbeads פאראמגנטי ניתן להשתמש. כאן אנו מציגים פרוטוקול באמצעות חרוזים מגנטיים להחיל כוחות לחלבונים דבקים פני תא. בגישה זו, אפשר לחקור מסלולי איתות ציטופלסמית כוח תלוי רק לא על ידי גישות ביוכימיות שונות, אלא גם שיפוץ הידבקות על ידי בידוד מגנטי של מתחמי הידבקות מצורפים החרוזים מצופים ליגנד. פרוטוקול זה כולל הכנת שיתוף ליגנדחרוזי פאראמגנטי ated, ואת היישום של להגדיר כוחות מתיחים ואחריו ניתוחים ביוכימיים. בנוסף, אנו מספקים מדגם מייצג של נתונים הוכחת מתח שחל על הידבקות מבוססת integrin מפעיל שיפוץ הידבקות ומשנת זירחון החלבון טירוזין.
בשנת metazoa, מתח מכני מכוון התפתחות רקמת הומאוסטזיס באמצעות הסדרת מספר עצום של תהליכים תאיים כגון התפשטות, בידול הישרדות 1, 2. מתח מכאני יכול לנבוע מטריקס או יכול להיוצר על ידי תאים חסידים, אשר מדגם הסביבה התאית שלהם באמצעות מכונות התכווצות actomyosin שמושכות אל תאי מטריקס וזונדים הנוקשים שלה באמצעות מולקולות מתח רגיש. בתגובת מתח, חלבוני הידבקות mechanosensitive לעבור שינויים מרחביים המפעילים מפלי איתות מורכבים. בתורו, מסלולי איתות אלה לתזמר mechanoresponse מקיף התפשטות, בידול והישרדות אשר מתאים את ההתנהגות הסלולר לסביבה התאית. ניתן ליישבם תהליכים כאלה בתוך פרק זמן קצר....
1. ליגנד הצמידה כדי חרוזים מגנטיים
הערה: נטיה ליגנד מתבצע באמצעות חרוזים פאראמגנטי המופעל Tosyl עם 2.8 מיקרומטר קוטר (ריכוז פתרון המניות 10 8 חרוזים / מ"ל, 30 חרוזים מ"ג / מ"ל). הפרוטוקול הבא מבוסס על דגימות של כ 2 x 10 5 תאים, .......
סכמטית של הטכניקה מודגמת באיור 1 א. בעקבות נטייה ליגנד, חרוזים מגנטיים מודגרת עם תאים במשך 20 דקות, ולאחר מכן מגנט קבוע משמש כדי להחיל כוחות מתיחים של כ 30-40 pN עבור כמות זמן שונה. 1b איור מראה 2.8 מיקרומטר חרוזים מגנטיים מצופה FN כבול קולטנים הידבקות התא MRC5. .......
השיטה המתוארת כאן מהווה גישה פשוטה ליישם מתח לקולטנים הדבקה פני תא ולאפשר הטיהור הבאה שלהם. עם זאת, כמה צעדים חיוניים כדי לבצע טיהור הדבקה יעילה אופטימיזציה פוטנציאלי יכולים להיעשות בהתאם קולטנים הידבקות הממוקדות. אנו מציגים בעיות פוטנציאליות המשתמש עלול להיתקל בה?.......
CG נתמך על ידי תרומות של סוכנות הידיעות הלאומית de la משוכלל ונדיר (ANR-13-JSV1-0008), מתוכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (n˚8304162 אינטגרציה מארי קירי קריירה) ומן המועצה האירופית למחקר (ERC) תחת אופק של האיחוד האירופי 2020 מחקר תוכנית חדשנות (n˚639300 גרנט המוצא ERC).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | DX88-N52 | grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick |
Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | D84PC-BLK | grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated |
Dynabeads M280 Tosylactivated | Thermofisher | 14203 | superparamagnetic beads |
DynaMag-2 Magnet | Thermofisher | 12321D | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | Fibronectin from bovine plasma |
Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1428-50MG | Bovine Apo-Transferrin |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate | Life Technologies | 31966-021 | DMEM+GlutaMAX-I 500 ml |
60*15 mm culture dish | Falcon | 353004 |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved