Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
aderenze superficie cellulare sono centrali in meccanotrasduzione, in quanto trasmettono tensione meccanica e avviare le vie di segnalazione coinvolte nella omeostasi dei tessuti e lo sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo per sezionare i percorsi biochimici che si attivano in risposta a tensione, utilizzando microsfere magnetiche rivestite ligando e di applicazione della forza di recettori di adesione.
Meccanosensibili complessi di adesione cellulare, consentono alle cellule di percepire le proprietà meccaniche del loro ambiente. Recenti studi hanno identificato due molecole di forza-sensing in siti di adesione, e fattori di trascrizione della forza-dipendente che regolano l'espressione genica specifica per lignaggio e guidano uscite fenotipici. Tuttavia, le reti di segnalazione di conversione della tensione meccanica in percorsi biochimici sono rimasti sfuggente. Per esplorare le vie di segnalazione impegnate su tensione meccanica applicata al recettore sulla superficie cellulare, microsfere superparamagnetiche possono essere utilizzati. Qui vi presentiamo un protocollo per l'utilizzo di sfere magnetiche per applicare forze di proteine di adesione della superficie cellulare. Usando questo approccio, è possibile indagare non solo forza-dipendente percorsi citoplasmatica segnalazione di vari approcci biochimici, ma anche l'adesione rimodellamento isolamento magnetico di complessi di adesione attaccate alle perline rivestite ligando. Questo protocollo include la preparazione di ligando-coATED perline superparamagnetiche, e l'applicazione di definiscono forze di trazione seguita da analisi biochimiche. Inoltre, forniamo un campione rappresentativo di dati che dimostrino che la tensione applicata ad adesione integrina-based innesca adesione rimodellamento e altera la proteina fosforilazione della tirosina.
In metazoi, tensione meccanica dirige lo sviluppo dei tessuti e l'omeostasi attraverso la regolazione di una miriade di processi cellulari quali la proliferazione, il differenziamento e la sopravvivenza 1, 2. tensione meccanica può derivare dalla matrice extracellulare o può essere generato da cellule aderenti, quale campione loro ambiente extracellulare attraverso l'apparato contrattile actomyosin che tira sulla matrice extracellulare e sonde sua rigidità attraverso molecole sensibili alla tensione. In risposta alla tensione, proteine di adesione meccanosensibili subiscono cambiamenti conformaziona....
1. Ligand coniugazione di biglie magnetiche
Nota: coniugazione Ligand viene eseguita utilizzando superparamagnetiche perline tosyl-attivato con un 2,8 micron di diametro (concentrazione della soluzione 10 8 perline / mL, 30 mg perline / ml). Il seguente protocollo si basa su campioni di circa 2 x 10 5 cellule, che corrispondono alle MRC-5 cellule cresciute al 80% di confluenza in una piastra di coltura tissutale 60mm. Regolare il volume di perline e reagenti di conseguenz.......
Lo schema della tecnica è illustrata in Figura 1a. Dopo coniugazione ligando, sfere magnetiche vengono incubate con le cellule per 20 minuti, e quindi un magnete permanente è utilizzato per applicare forze di trazione di circa 30-40 pN per vario tempo. La figura 1b mostra 2,8 micron sfere magnetiche FN-rivestiti legati ai recettori di adesione cellulare MRC5.
Le fasi di lavaggio di perline superparamagnetiche dopo la lisi cellulare sono cruciali e determin.......
Il metodo descritto qui costituisce un approccio semplice da applicare tensione ai recettori di adesione cellulare, e consentire loro purificazione successiva. Tuttavia, alcuni passi sono fondamentali per eseguire efficiente purificazione adesione e potenziale di ottimizzazione può essere fatto a seconda delle recettori di adesione mirati. Vi presentiamo i potenziali problemi che si possono riscontrare in basso.
Abbiamo usato sfere magnetiche 2,8 micron di diametro, ma perle più grandi pos.......
CG è sostenuto da sovvenzioni dal Agence National de la Recherche (ANR-13-JSV1-0008), a titolo del Settimo programma quadro dell'Unione europea (Marie Curie integrazione carriera n˚8304162) e dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito di Orizzonte dell'Unione europea 2020 programma di ricerca e innovazione (ERC Starting Grant n˚639300).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | DX88-N52 | grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick |
Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | D84PC-BLK | grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated |
Dynabeads M280 Tosylactivated | Thermofisher | 14203 | superparamagnetic beads |
DynaMag-2 Magnet | Thermofisher | 12321D | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | Fibronectin from bovine plasma |
Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1428-50MG | Bovine Apo-Transferrin |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate | Life Technologies | 31966-021 | DMEM+GlutaMAX-I 500 ml |
60*15 mm culture dish | Falcon | 353004 |
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