磁気ビーズを使用した機械的張力に応答して細胞表面接着リフォームの分析

彼らは機械的張力を送信し、組織の恒常性と開発に関与するシグナル伝達経路を開始するように、細胞表面の癒着は、メカノの中心です。ここでは、接着受容体へのリガンドで被覆された磁性マイクロビーズと力のアプリケーションを使用して、張力に応答して活性化される生化学的経路を切開するためのプロトコルを提示します。

機械受容細胞表面接着複合体は、細胞がその周囲の機械的特性を感知することを可能にします。最近の研究では、接着部位での力感知分子、および系統特異的遺伝子の発現を調節し、表現型出力を駆動力依存性転写因子の両方を同定しました。しかし、生化学的経路に機械的張力を変換するシグナル伝達ネットワークは、とらえどころのないままです。細胞表面受容体に適用される機械的張力の際に係合したシグナル伝達経路を探索するために、超常磁性マイクロビーズを使用することができます。ここでは、細胞表面接着タンパク質に力を適用するために磁気ビーズを使用するためのプロトコルを提示します。このアプローチを使用して、様々な生化学的アプローチによってのみならず力依存性細胞質のシグナル伝達経路を調査することが可能であるが、リガンドでコーティングされたビーズに付着した接着複合体の磁気分離によってリモデリングを接着します。このプロトコルは、リガンド - コの準備を含んでいます超常磁性ビーズをated、と定義する引張力の適用は、生化学的分析が続きます。さらに、我々はインテグリンベースの接着に適用し、そのテンションを実証するデータの代表的なサンプルを提供する接着改造をトリガし、タンパク質チロシンリン酸化を変化させます。

後生動物では、機械的張力は、増殖、分化および生存^1、2などの細胞プロセスの無数の調節を介して組織発達および恒常性を指示します。機械的張力は、細胞外マトリックスから生じ得るか、接着性細胞、サンプル細胞外マトリックス上に引っ張ると緊張に敏感な分子を介してその剛性をプローブアクトミオシン収縮機構を介して、それらの細胞外環境を生成することができます。張力に応じて、機械受容接着タンパク質は、複雑なシグナル伝達カスケードを誘発する立体配座の変化を受けます。次に、これらのシグナル伝達経路は、細胞外環境への細胞の挙動を調節、増殖、分化および生存を包含するmechanoresponseを調整します。このようなプロセスはすぐにメカのループにフィードバックするために短期的な期間（数秒から数分）で決済することができます機械受容の構造を変更することによってnotransduction。例えば、インテグリンベースの接着は、Rho GTPアーゼによって媒介される細胞骨格リモデリング^3、4、5を介して張力に応じて強化します。並行して、他のシグナル伝達経路は、最終的に細胞の運命^6に影響

磁気ビーズに1リガンド抱合

注：リガンド結合は、2.8μmの直径（原液濃度が10 ⁸ビーズ/ mLで、30mgのビーズ/ mL）で超常磁性トシル活性化ビーズを使用して実行されます。以下のプロトコルを、60 mm組織培養プレートにおいて80％コンフルエンシーまで増殖させたMRC-5細胞に相当する約2×10 ⁵細胞のサンプルに基づいています。それに応じて異なる合流で異なるサ?.......

技術の概略は 、 図1Aに示されています。リガンド結合後、磁気ビーズを20分間、細胞と共にインキュベートされ、その後、永久磁石は、時間の様々な量を約30〜40 pNでの引張力を適用するために使用されます。 図1bは、MRC5細胞接着受容体に結合した2.8μmのFNで被覆した磁気ビーズを示します。

細胞溶解後の超常磁性ビーズの洗浄ステ?.......

ここで説明する方法は、細胞表面接着受容体に張力を適用し、それらのその後の精製を可能にする簡単な方法を構成しています。しかし、いくつかのステップは、効率的な接着精製および潜在的な最適化を行うことが重要である標的接着受容体に依存して行うことができます。私たちは、ユーザーが以下の発生する可能性のある潜在的な問題を提示します。

我々は、2.8μ.......

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