Analysere Cell Surface Adhesjon Ombygging i Response til Mekanisk Tension Bruke magnetiske kuler

Celleoverflatevoksninger er sentrale i mechanotransduction, som de overfører mekanisk spenning og iverksette de signalveier involvert i vev homeostase og utvikling. Her presenterer vi en protokoll for å dissekere de biokjemiske mekanismer som aktiveres i respons til spenning, ved hjelp av ligand-belagt magnetiske mikroperler og kraft søknad til vedheft reseptorer.

Mechanosensitive celleoverflate adhesjons komplekser tillate cellene å avføle de mekaniske egenskapene til sine omgivelser. Nyere studier har identifisert både kraft-sensing molekyler på vedheft områder, og tvinge avhengig transkripsjonsfaktorer som regulerer avstamning spesifikke genuttrykk og drive fenotypiske utganger. Imidlertid har signalnettverk konvertere mekanisk spenning i biokjemiske mekanismer vært unnvikende. For å utforske de signalveier som driver etter en mekanisk spenning som er påført celleoverflatereseptor, kan superparamagnetiske mikrokuler anvendes. Her presenterer vi en protokoll for å bruke magnetiske kuler for å bruke kreftene til celleoverflate adhesjonsproteiner. Ved hjelp av denne metode, er det mulig å undersøke ikke bare kraftavhengig cytoplasmatiske signalbaner av forskjellige biokjemiske metoder, men også adhesjon remodellering av magnetisk isolasjon av adhesjons komplekser festet til ligand-belagte kuler. Denne protokollen innbefatter fremstilling av ligand-corerte superparamagnetiske perler, og anvendelse av definere strekkrefter fulgt av biokjemiske analyser. I tillegg tilbyr vi et representativt utvalg av data som viser at spenning påføres intebasert heft utløser heft ombygging og endrer protein tyrosin fosforylering.

I metazoer, retning og mekanisk spenning vev utvikling og homeostase gjennom regulering av en myriade av cellulære prosesser som proliferasjon, differensiering og overlevelse ^{1, 2.} Mekaniske spenninger kan oppstå fra den ekstracellulære matriks eller kan genereres av adherente celler, som prøve deres ekstracellulære miljø gjennom actomyosin kontraktile maskiner som trekker ut mot ekstracellulær matriks og sonder dens stivhet ved spenningsfølsomme molekyler. Som svar på spenning, mechanosensitive adhesjonsproteiner gjennomgå konformasjonsforandringer endringer som utløser komplekse signalkaskader. I sin tur, d....

1. Ligand Bøyning til magnetiske kuler

Bemerk: Ligand konjugering utføres ved hjelp av superparamagnetiske tosyl-aktiverte kuler med en 2,8 um diameter (stamoppløsning konsentrasjon 10 ⁸ perler / ml, 30 mg kuler / ml). Den følgende protokollen er basert på prøver av omtrent 2 x 10 ⁵ celler, som tilsvarer MRC-5-celler dyrket til 80% konfluens i en 60 mm vevskulturskål. Juster volumet av perler og reagenser tilsvarende ved bruk plater av forskjellige størrelser elle.......

Skjematisk av den teknikk som er illustrert i figur 1a. Etter ligand konjugasjon, er magnetiske kuler inkubert med cellene i 20 minutter, og deretter en permanent magnet anvendes for å påføre strekkrefter på omtrent 30-40 pN for forskjellige tidsrom. Figur 1b viser 2,8 um FN-belagte magnetiske kuler bundet til MRC5 celle-adhesjonsreseptorer.

Vasketrinnet av superparamagnetiske kuler etter cellelyse er avgjørende, og bestemme graden av rensing. Et minimu.......

Metoden som er beskrevet her danner en grei måte å påføre spenning til celleoverflate adhesjonsreseptorer og tillate deres påfølgende rensing. Men noen trinn er kritisk for å utføre effektiv adhesjon rensing og eventuell optimering kan gjøres avhengig av den målrettede adhesjonsreseptorer. Vi presenterer potensielle problemer brukeren kan oppstå under.

Vi brukte 2,8 um diameter magnetiske kuler men større perler kan anvendes, slik som 4,5 um diameter. Imidlertid bør kulediameter.......

CG er støttet med tilskudd fra Agence National de la Recherche (ANR-13-JSV1-0008), fra EU syvende rammeprogram (Marie Curie Career Integration n˚8304162) og fra European Research Council (ERC) under EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram (ERC Starting Grant n˚639300).