JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Biology

Анализ клеточной поверхности адгезии Ремоделирование в ответ на механическое напряжение с помощью магнитных шариков

Published: March 8th, 2017

DOI:

10.3791/55330

1Institute for Advanced Biosciences, Centre de recherche UGA - INSERM U1209 - CNRS UMR
* These authors contributed equally

клеточной поверхности спайки являются центральными в механотрансдукции, так как они передают механические напряжения и инициировать сигнальных путей, вовлеченных в гомеостаз ткани и развития. Здесь мы приводим протокол для рассечения биохимических путей, которые активируются в ответ на напряжение, используя лиганд покрытием магнитные микрогранулы и применение силы к адгезионных рецепторов.

Механочувствительных адгезии комплексы клеточной поверхности позволяют клеткам ощущать механические свойства их окружения. Недавние исследования выявили как силы зондирования молекул на адгезионных участков, а сила-зависимых факторов транскрипции, которые регулируют экспрессию генов LINEAGE-специфических и драйвом фенотипические выходы. Однако сигнальные сети преобразующие механическую напряженность в биохимических путей, которые остаются неясными. Для изучения сигнальных путей, участвующих на механического напряжения, приложенного к рецептором клеточной поверхности, могут быть использованы суперпарамагнитныо микрогранулы. Здесь мы приводим протокол для использования магнитных шариков для применения силы на клеточной поверхности адгезии белков. Используя этот подход, можно исследовать не только силы-зависимых цитоплазматический сигнальных путей от различных биохимических подходов, но и адгезии ремоделирования магнитной изоляции адгезионных комплексов, присоединенных к лиганд-покрытием бусин. Этот протокол включает в себя подготовку лиганд-сотрудничестваованные суперпарамагнитныо бусы и применение определить силы растяжения с последующим биохимических анализов. Кроме того, мы предоставляем репрезентативную выборку данных, показывающих, что напряжение применяется к адгезии интегрина на основе триггеров адгезии ремоделирования и изменяет белковый фосфорилирования тирозина.

В многоклеточных, механическое напряжение направляет развитие тканей и гомеостаз посредством регуляции множества клеточных процессов , таких как пролиферации, дифференцировки и выживания 1, 2. Механическое напряжение может возникать из внеклеточного матрикса или могут быть получены с помощью адгезивных клеток, которые образец их внеклеточную среду через актомиозиновом сократительной механизма, который вытягивает на внеклеточный матрикс и зонды его жесткость при натяжении чувствительных молекул. В ответ на напряжение, механочувствительных белки адгезии претерпевают конформационные изменения, которые вызывают с....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Лиганд Конъюгирование магнитные шарики

Примечание: Лиганд конъюгация осуществляется с использованием суперферромагнитных тозил активированные бусины диаметром 2,8 мкм (концентрация исходного раствора 10 8 бусин / мл, 30 мг бусин / мл). Следующий протокол основан на ?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Схема методики показана на рисунке 1a. После лиганда конъюгации, магнитные гранулы инкубировали с клетками в течение 20 мин, а затем постоянный магнит используется для применения сил растяжения около 30-40 пН для различного количества времени. Рисунок 1b показывает 2,8 мкм .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Описанный здесь метод представляет собой простой подход, чтобы применить напряжение к клеточной поверхности рецепторов адгезии и позволяют их последующую очистку. Тем не менее, некоторые шаги имеют решающее значение для выполнения эффективной очистки адгезии и потенциал оптимизаци?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

CG поддерживается за счет грантов от Национального агентства-де-ла-Recherche (ANR-13-JSV1-0008), из седьмой рамочной программы Европейского союза (Мари Кюри Карьера интеграции n˚8304162) и от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках Horizon Европейского Союза 2020 исследований и инноваций программы (ERC Запуск Грант n˚639300).

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish)K&J Magnetics, IncDX88-N52grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick
Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish)K&J Magnetics, IncD84PC-BLKgrade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated 
Dynabeads M280 TosylactivatedThermofisher14203superparamagnetic beads 
DynaMag-2 MagnetThermofisher12321D
Fibronectin Sigma-AldrichF1141-5MGFibronectin from bovine plasma
Poly-D-LysineSigma-AldrichP7280-5MG
Apo-TransferrinSigma-AldrichT1428-50MGBovine Apo-Transferrin
Bovine serum albuminSigma-AldrichA7906-500G
DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate Life Technologies31966-021DMEM+GlutaMAX-I 500 ml 
60*15 mm culture dishFalcon353004

  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. . Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  2. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (5), 308-319 (2011).
  3. Guilluy, C., et al. The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins. Nat Cell Biol. 13 (6), 722-727 (2011).
  4. Matthews, B. D., Overby, D. R., Mannix, R., Ingber, D. E. Cellular adaptation to mechanical stress: role of integrins, Rho, cytoskeletal tension and mechanosensitive ion channels. J Cell Sci. 119 (3), 508-518 (2006).
  5. Zhao, X. -. H., et al. Force activates smooth muscle alpha-actin promoter activity through the Rho signaling pathway. J Cell Sci. 120 (Pt 10), 1801-1809 (2007).
  6. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  7. Austen, K., Kluger, C., Freikamp, A., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. Generation and analysis of biosensors to measure mechanical forces within cells. Meth Mol Biol. 1066, 169-184 (2013).
  8. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  9. Pelham, R. J., Wang, Y. l. . Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci USA. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  10. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  11. Chaudhuri, O., Parekh, S. H., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Combined atomic force microscopy and side-view optical imaging for mechanical studies of cells. Nat Meth. 6 (5), 383-387 (2009).
  12. Bays, J. L., et al. Vinculin phosphorylation differentially regulates mechanotransduction at cell-cell and cell-matrix adhesions. J Cell Biol. 205 (2), 251-263 (2014).
  13. Collins, C., et al. Localized tensional forces on PECAM-1 elicit a global mechanotransduction response via the integrin-RhoA pathway. Curr Biol. 22 (22), 2087-2094 (2012).
  14. Gordon, W. R., et al. Mechanical Allostery: Evidence for a Force Requirement in the Proteolytic Activation of Notch. Dev Cell. 33 (6), 729-736 (2015).
  15. Lessey-Morillon, E. C., et al. The RhoA guanine nucleotide exchange factor, LARG, mediates ICAM-1-dependent mechanotransduction in endothelial cells to stimulate transendothelial migration. J Immunol. 192 (7), 3390-3398 (2014).
  16. Osborne, L. D., et al. TGF-β regulates LARG and GEF-H1 during EMT to affect stiffening response to force and cell invasion. Mol Biol Cell. 25 (22), 3528-3540 (2014).
  17. Scott, D. W., Tolbert, C. E., Burridge, K. Tension on JAM-A activates RhoA via GEF-H1 and p115 RhoGEF. Mol Biol Cell. 27 (9), 1420-1430 (2016).
  18. Glogauer, M., Ferrier, J., McCulloch, C. A. Magnetic fields applied to collagen-coated ferric oxide beads induce stretch-activated Ca2+ flux in fibroblasts. Am J Physiol - Cell Physiol. 269 (5), C1093-C1104 (1995).
  19. Glogauer, M., et al. Calcium ions and tyrosine phosphorylation interact coordinately with actin to regulate cytoprotective responses to stretching. J Cell Sci. 110 (Pt 1), 11-21 (1997).
  20. Kuo, J. -. C., Han, X., Hsiao, C. -. T., Yates, J. R., Waterman, C. M. Analysis of the myosin-II-responsive focal adhesion proteome reveals a role for β-Pix in negative regulation of focal adhesion maturation. Nat Cell Biol. 13 (4), 383-393 (2011).
  21. Schiller, H. B., et al. β1- and αv-class integrins cooperate to regulate myosin II during rigidity sensing of fibronectin-based microenvironments. Nat Cell Biol. 15 (6), 625-636 (2013).
  22. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nat Cell Biol. 16 (4), 376-381 (2014).
  23. Plopper, G. E., McNamee, H. P., Dike, L. E., Bojanowski, K., Ingber, D. E. Convergence of integrin and growth factor receptor signaling pathways within the focal adhesion complex. Mol Biol Cell. 6 (10), 1349-1365 (1995).
  24. Roca-Cusachs, P., Gauthier, N. C., Del Rio, ., A, M. P., Sheetz, Clustering of alpha(5)beta(1) integrins determines adhesion strength whereas alpha(v)beta(3) and talin enable mechanotransduction. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (38), 16245-16250 (2009).
  25. Ajeian, J. N., et al. Proteomic analysis of integrin-associated complexes from mesenchymal stem cells. Proteomics Clin Appl. 10 (1), 51-57 (2016).
  26. Horton, E. R., Astudillo, P., Humphries, M. J., Humphries, J. D. Mechanosensitivity of integrin adhesion complexes: Role of the consensus adhesome. Exp Cell Res. , (2015).
  27. Jones, M. C., et al. Isolation of integrin-based adhesion complexes. Curr Protoc Cell Biol. 66, 9.8.1-9.8.15 (2015).
  28. Ng, D. H. J., Humphries, J. D., Byron, A., Millon-Frémillon, A., Humphries, M. J. Microtubule-dependent modulation of adhesion complex composition. PloS One. 9 (12), e115213 (2014).
  29. Byron, A., Humphries, J. D., Bass, M. D., Knight, D., Humphries, M. J. Proteomic analysis of integrin adhesion complexes. Sci Sign. 4 (167), pt2 (2011).
  30. Byron, A., Humphries, J. D., Craig, S. E., Knight, D., Humphries, M. J. Proteomic analysis of α4β1 integrin adhesion complexes reveals α-subunit-dependent protein recruitment. Proteomics. 12 (13), 2107-2114 (2012).
  31. Marjoram, R. J., Guilluy, C., Burridge, K. Using magnets and magnetic beads to dissect signaling pathways activated by mechanical tension applied to cells. Methods. , (2015).
  32. Pasapera, A. M., Schneider, I. C., Rericha, E., Schlaepfer, D. D., Waterman, C. M. Myosin II activity regulates vinculin recruitment to focal adhesions through FAK-mediated paxillin phosphorylation. J Cell Biol. 188 (6), 877-890 (2010).
  33. Sawada, Y., Sheetz, M. P. Force transduction by Triton cytoskeletons. J Cell Biol. 156 (4), 609-615 (2002).
  34. Grinnell, F., Geiger, B. Interaction of fibronectin-coated beads with attached and spread fibroblasts. Binding, phagocytosis, and cytoskeletal reorganization. Exp Cell Res. 162 (2), 449-461 (1986).
  35. Schroeder, F., Kinden, D. A. Measurement of phagocytosis using fluorescent latex beads. J Biochem Biophys Meth. 8 (1), 15-27 (1983).
  36. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
  37. Seo, D., et al. A Mechanogenetic Toolkit for Interrogating Cell Signaling in Space and Time. Cell. 165 (6), 1507-1518 (2016).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved