El análisis de la superficie celular Adhesión Remodeling en respuesta a la tensión mecánica usando perlas magnéticas

adherencias de la superficie celular son fundamentales en mechanotransduction, ya que transmiten la tensión mecánica e inician las vías de señalización implicadas en la homeostasis del tejido y el desarrollo. A continuación, presentamos un protocolo para la disección de las vías bioquímicas que se activan en respuesta a la tensión, utilizando microperlas magnéticas recubiertas con ligando y aplicación de la fuerza a los receptores de adhesión.

mechanosensitive complejos de adhesión que permiten a las células detectar las propiedades mecánicas de su entorno. Estudios recientes han identificado ambas moléculas de detección de la fuerza en los sitios de adhesión, y factores de transcripción dependiente de la fuerza que regulan la expresión de genes específicos de linaje y conducen salidas fenotípicas. Sin embargo, las redes de señalización de conversión de la tensión mecánica en las vías bioquímicas han sido difícil de alcanzar. Para explorar las vías de señalización dedicadas a la tensión mecánica aplicada a receptor de superficie celular, microperlas superparamagnéticas se pueden utilizar. Aquí se presenta un protocolo para el uso de perlas magnéticas para aplicar fuerzas a las proteínas de adhesión de la superficie celular. Utilizando este enfoque, es posible investigar no sólo las vías de señalización citoplásmica dependiente de la fuerza por diversos enfoques bioquímicos, sino también el remodelado adhesión por aislamiento magnético de los complejos de adhesión unidos a las perlas de ligando-revestido. Este protocolo incluye la preparación de ligando-coperlas superparamagnéticas ATED, y la aplicación de fuerzas de tracción definen seguido de análisis bioquímicos. Además, ofrecemos una muestra representativa de los datos que demuestran que la tensión aplicada a la adhesión a base de integrina desencadena remodelación adherencia y altera la fosforilación de la proteína tirosina.

En metazoos, la tensión mecánica dirige el desarrollo de tejido y la homeostasis a través de la regulación de una gran variedad de procesos celulares tales como la proliferación, la diferenciación y la supervivencia ^{1, 2.} tensión mecánica puede surgir de la matriz extracelular o puede ser generada por las células adherentes, que muestra su ambiente extracelular a través de la maquinaria contráctil actomiosina que tira en la matriz extracelular y las sondas de su rigidez a través de moléculas de tensión y minúsculas. En respuesta a la tensión, las proteínas de adhesión mechanosensitive experimentan cambios con....

1. Ligando Conjugación con perlas magnéticas

Nota: la conjugación del ligando se lleva a cabo usando perlas activadas con tosilo superparamagnéticas con un 2,8 m de diámetro (concentración de la solución de stock 10 ⁸ cuentas / ml, 30 mg de perlas / ml). El siguiente protocolo se basa en muestras de aproximadamente 2 x 10 ⁵ células, que corresponden a las células MRC-5 cultivadas a 80% de confluencia en una placa de cultivo de tejidos de 60 mm. Ajuste el volumen .......

El esquema de la técnica se ilustra en la Figura 1a. Después de la conjugación ligando, perlas magnéticas se incubaron con las células durante 20 min, y a continuación, un imán permanente se utiliza para aplicar fuerzas de tracción de alrededor de 30 a 40 pN para diversas cantidades de tiempo. La Figura 1b muestra 2.8 micras perlas magnéticas recubiertas con FN con destino a los receptores de adhesión celular MRC5.

Los pasos de lavado de perlas sup.......

El método descrito aquí constituye un enfoque directo para aplicar tensión a los receptores de adhesión de la superficie celular y permitir su posterior purificación. Sin embargo, algunas medidas son fundamentales para llevar a cabo la purificación de adhesión eficiente y la optimización potencial se puede hacer en función de los receptores de adhesión específicas. Presentamos los posibles problemas que el usuario pueda encontrar a continuación.

Se utilizó perlas magnéticas de .......

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