JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Biology

Manyetik Boncuk Kullanarak Mekanik Gerilim Cevabı Hücre Yüzey Yapışma Modelleme Analizi

Published: March 8th, 2017

DOI:

10.3791/55330

1Institute for Advanced Biosciences, Centre de recherche UGA - INSERM U1209 - CNRS UMR
* These authors contributed equally

mekanik gerilim iletmek ve doku homeostazında ve geliştirme dahil sinyal yollarını başlatmak gibi hücre yüzey yapışıklıklar, mechanotransduction merkezi bulunmaktadır. Burada, ligand kaplı manyetik mikroboncukları ve yapışma reseptörlerine kuvvet uygulaması ile, gerilim cevap olarak aktive edilir biyokimyasal yollar kesme için bir protokol mevcut.

Mechanosensitive hücre yüzeyi yapışma kompleksleri hücreler ortamda mekanik özellikleri duyu sağlar. Son zamanlarda yapılan çalışmalar adhezyon bölgelerinin kuvvet algılayıcı molekülleri, ve soy spesifik gen ekspresyonunu düzenleyen ve fenotipik çıktıları sürücü kuvveti bağımlı transkripsiyon faktörlerini belirledik. Ancak, biyokimyasal yollar içine mekanik gerilim dönüştürme sinyal ağları yakalanması zor kalmıştır. hücre yüzey reseptörüne uygulanan mekanik gerilim ile yapan sinyal yollarını araştırmak için, süperparamanyetik mikroboncuklar kullanılabilir. Burada hücre yüzeyi yapışma proteinlerine kuvvetleri uygulamak için, manyetik boncuklar kullanılarak bir protokol mevcut. Bu yaklaşımı kullanarak, ligand kaplı boncuklara bağlı yapışma kompleksleri manyetik izolasyonu ile, sadece bir güç bağımlı çeşitli biyokimyasal yaklaşımlar ile sitoplazmik sinyal yollarını ancak yapışma biçimlenme araştırılması mümkündür. Bu protokol ligand-co hazırlanmasını içermektedirated Süperparamanyetik boncuklar ve uygulama biyokimyasal analizler takip gerilme kuvvetleri tanımlar. Ayrıca, integrin tabanlı yapışma uygulanan gerilimin gösteren verilerin temsili numune yapışma biçimlenme tetikler ve protein tirozin fosforilasyonu değiştirir sağlar.

Metazoada olarak, mekanik gerilme, proliferasyon, farklılaşma ve canlılık, 1, 2 gibi hücresel süreçleri sayısız düzenleme ile doku gelişimi ve homeostazı yönlendirir. Mekanik gerilim hücre dışı matrisin ortaya çıkabilir veya yapışık hücreler, örnek hücre-dışı matris üzerine çeker ve gerginlik duyarlı moleküllerin yoluyla sertliğini probları aktomiyosin kontraktil makineler yoluyla hücre dışı ortamı ile üretilebilir. gerilime karşılık olarak, mechanosensitive yapışma proteinleri, karmaşık bir sinyal gruplarının tetiklenmesinde uygun değişikliklere uğrar. Buna karşılık, bu sinyal yolları....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Manyetik Boncuk 1. Ligand Konjugasyon

Not: Ligand konjügasyon 2.8 mikron çapında olan süperparamanyetik tosil-aktive boncuklar kullanılarak gerçekleştirilir (stok çözelti konsantrasyonu 10 8 boncuk / mL, 30 mg tane / mL) eklenmiştir. Aşağıdaki protokol, bir 60 mm doku kültürü plakası içinde% 80 konfluansa büyütülmüş MRC-5 hücreleri için uygun, yaklaşık 2 x 10 5 hücre, örnekleri dayanır. buna göre farklı akışlar farklı boyutlarda veya hü.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tekniğin şematik Şekil 1a'da gösterilmektedir. Ligand konjugasyon sonra, manyetik boncuk 20 dakika için hücreler ile kuluçkalanmıştır, ve daha sonra, kalıcı bir mıknatısın, çeşitli zaman miktarı için yaklaşık 30-40 pN gerilme kuvvetleri uygulamak için kullanılır. Şekil 1b MRC5 hücre yapışma reseptörlerine bağlanan 2.8 um FN-kaplı manyetik boncuklar gösterir.

Hücre Parçalama işleminden sonra Süperparamanyetik boncuk yı.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada tarif edilen yöntem, hücre yüzeyi yapışma reseptörlerine gerilim uygulamak ve daha sonra saflaştırmaya olanak sağlamak üzere basit bir yaklaşım oluşturmaktadır. Ancak, bazı adımlar hedeflenen yapışma reseptörleri bağlı verimli yapışma arıtma ve potansiyel iyileştirme yapılabilir gerçekleştirmek için kritik öneme sahiptir. Biz kullanıcı aşağıda karşılaşabileceğiniz olası sorunları sunuyoruz.

Bu 2.8 mikron çapında manyetik boncuklar kullanılab.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

CG, Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı Agence National de la Recherche (ANR-13-JSV1-0008), (Marie Curie Kariyer Entegrasyon n˚8304162) ve Avrupa Birliği'nin Horizon kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) hibe tarafından desteklenmektedir 2020 araştırma ve yenilik programı (ERC Başlangıç ​​Hibe n˚639300).

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish)K&J Magnetics, IncDX88-N52grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick
Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish)K&J Magnetics, IncD84PC-BLKgrade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated 
Dynabeads M280 TosylactivatedThermofisher14203superparamagnetic beads 
DynaMag-2 MagnetThermofisher12321D
Fibronectin Sigma-AldrichF1141-5MGFibronectin from bovine plasma
Poly-D-LysineSigma-AldrichP7280-5MG
Apo-TransferrinSigma-AldrichT1428-50MGBovine Apo-Transferrin
Bovine serum albuminSigma-AldrichA7906-500G
DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate Life Technologies31966-021DMEM+GlutaMAX-I 500 ml 
60*15 mm culture dishFalcon353004

  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. . Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  2. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (5), 308-319 (2011).
  3. Guilluy, C., et al. The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins. Nat Cell Biol. 13 (6), 722-727 (2011).
  4. Matthews, B. D., Overby, D. R., Mannix, R., Ingber, D. E. Cellular adaptation to mechanical stress: role of integrins, Rho, cytoskeletal tension and mechanosensitive ion channels. J Cell Sci. 119 (3), 508-518 (2006).
  5. Zhao, X. -. H., et al. Force activates smooth muscle alpha-actin promoter activity through the Rho signaling pathway. J Cell Sci. 120 (Pt 10), 1801-1809 (2007).
  6. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  7. Austen, K., Kluger, C., Freikamp, A., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. Generation and analysis of biosensors to measure mechanical forces within cells. Meth Mol Biol. 1066, 169-184 (2013).
  8. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  9. Pelham, R. J., Wang, Y. l. . Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci USA. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  10. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  11. Chaudhuri, O., Parekh, S. H., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Combined atomic force microscopy and side-view optical imaging for mechanical studies of cells. Nat Meth. 6 (5), 383-387 (2009).
  12. Bays, J. L., et al. Vinculin phosphorylation differentially regulates mechanotransduction at cell-cell and cell-matrix adhesions. J Cell Biol. 205 (2), 251-263 (2014).
  13. Collins, C., et al. Localized tensional forces on PECAM-1 elicit a global mechanotransduction response via the integrin-RhoA pathway. Curr Biol. 22 (22), 2087-2094 (2012).
  14. Gordon, W. R., et al. Mechanical Allostery: Evidence for a Force Requirement in the Proteolytic Activation of Notch. Dev Cell. 33 (6), 729-736 (2015).
  15. Lessey-Morillon, E. C., et al. The RhoA guanine nucleotide exchange factor, LARG, mediates ICAM-1-dependent mechanotransduction in endothelial cells to stimulate transendothelial migration. J Immunol. 192 (7), 3390-3398 (2014).
  16. Osborne, L. D., et al. TGF-β regulates LARG and GEF-H1 during EMT to affect stiffening response to force and cell invasion. Mol Biol Cell. 25 (22), 3528-3540 (2014).
  17. Scott, D. W., Tolbert, C. E., Burridge, K. Tension on JAM-A activates RhoA via GEF-H1 and p115 RhoGEF. Mol Biol Cell. 27 (9), 1420-1430 (2016).
  18. Glogauer, M., Ferrier, J., McCulloch, C. A. Magnetic fields applied to collagen-coated ferric oxide beads induce stretch-activated Ca2+ flux in fibroblasts. Am J Physiol - Cell Physiol. 269 (5), C1093-C1104 (1995).
  19. Glogauer, M., et al. Calcium ions and tyrosine phosphorylation interact coordinately with actin to regulate cytoprotective responses to stretching. J Cell Sci. 110 (Pt 1), 11-21 (1997).
  20. Kuo, J. -. C., Han, X., Hsiao, C. -. T., Yates, J. R., Waterman, C. M. Analysis of the myosin-II-responsive focal adhesion proteome reveals a role for β-Pix in negative regulation of focal adhesion maturation. Nat Cell Biol. 13 (4), 383-393 (2011).
  21. Schiller, H. B., et al. β1- and αv-class integrins cooperate to regulate myosin II during rigidity sensing of fibronectin-based microenvironments. Nat Cell Biol. 15 (6), 625-636 (2013).
  22. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nat Cell Biol. 16 (4), 376-381 (2014).
  23. Plopper, G. E., McNamee, H. P., Dike, L. E., Bojanowski, K., Ingber, D. E. Convergence of integrin and growth factor receptor signaling pathways within the focal adhesion complex. Mol Biol Cell. 6 (10), 1349-1365 (1995).
  24. Roca-Cusachs, P., Gauthier, N. C., Del Rio, ., A, M. P., Sheetz, Clustering of alpha(5)beta(1) integrins determines adhesion strength whereas alpha(v)beta(3) and talin enable mechanotransduction. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (38), 16245-16250 (2009).
  25. Ajeian, J. N., et al. Proteomic analysis of integrin-associated complexes from mesenchymal stem cells. Proteomics Clin Appl. 10 (1), 51-57 (2016).
  26. Horton, E. R., Astudillo, P., Humphries, M. J., Humphries, J. D. Mechanosensitivity of integrin adhesion complexes: Role of the consensus adhesome. Exp Cell Res. , (2015).
  27. Jones, M. C., et al. Isolation of integrin-based adhesion complexes. Curr Protoc Cell Biol. 66, 9.8.1-9.8.15 (2015).
  28. Ng, D. H. J., Humphries, J. D., Byron, A., Millon-Frémillon, A., Humphries, M. J. Microtubule-dependent modulation of adhesion complex composition. PloS One. 9 (12), e115213 (2014).
  29. Byron, A., Humphries, J. D., Bass, M. D., Knight, D., Humphries, M. J. Proteomic analysis of integrin adhesion complexes. Sci Sign. 4 (167), pt2 (2011).
  30. Byron, A., Humphries, J. D., Craig, S. E., Knight, D., Humphries, M. J. Proteomic analysis of α4β1 integrin adhesion complexes reveals α-subunit-dependent protein recruitment. Proteomics. 12 (13), 2107-2114 (2012).
  31. Marjoram, R. J., Guilluy, C., Burridge, K. Using magnets and magnetic beads to dissect signaling pathways activated by mechanical tension applied to cells. Methods. , (2015).
  32. Pasapera, A. M., Schneider, I. C., Rericha, E., Schlaepfer, D. D., Waterman, C. M. Myosin II activity regulates vinculin recruitment to focal adhesions through FAK-mediated paxillin phosphorylation. J Cell Biol. 188 (6), 877-890 (2010).
  33. Sawada, Y., Sheetz, M. P. Force transduction by Triton cytoskeletons. J Cell Biol. 156 (4), 609-615 (2002).
  34. Grinnell, F., Geiger, B. Interaction of fibronectin-coated beads with attached and spread fibroblasts. Binding, phagocytosis, and cytoskeletal reorganization. Exp Cell Res. 162 (2), 449-461 (1986).
  35. Schroeder, F., Kinden, D. A. Measurement of phagocytosis using fluorescent latex beads. J Biochem Biophys Meth. 8 (1), 15-27 (1983).
  36. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
  37. Seo, D., et al. A Mechanogenetic Toolkit for Interrogating Cell Signaling in Space and Time. Cell. 165 (6), 1507-1518 (2016).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved