İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Özet

bir heterolog ifade sistemi ile incelenmesi iyon kanalları biyomedikal araştırmalarda bir çekirdek tekniği haline gelmiştir. Bu yazıda, bir uyarılabilir promoterin kontrolü altında geçici transfeksiyon gerçekleştirerek sıkı bir şekilde kontrol iyon kanal ekspresyonunu elde etmek için bir zaman etkili bir yöntem sunmaktadır.

Özet

Transfeksiyon, bir hücre içine yabancı nükleik asitlerin ulaştırılması protein araştırmaları güçlü bir araçtır. Bu yöntem sayesinde, iyon kanalları elektrofizyolojik analizi, biyokimyasal karakterizasyonu, mutasyon çalışmaları ve hücresel süreçlerin üzerindeki etkileri yoluyla incelenebilir. Geçici nakiller protein gün birkaç saat içinde analiz için kullanılabilir hale geldiği basit bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem nispeten basit ve etkili bir zaman protokolü sunulur, ancak önemli bir bileşendir analizi için uygun olan fizyolojik ilgili bu seviyeleri ilgi konusu genin ekspresyonunu kalibre edilir. Bu amaçla, söz konusu genin ekspresyonunu kontrol etmek olanağı sunan bir çok farklı yaklaşımlar ortaya çıkmıştır. Birkaç kararlı hücre transfeksiyon protokolleri kalıcı bir tetrasiklin kontrollü transkripsiyonu düzenlenmesi altında cep genomuna ilgilenilen geni tanıtmak için bir yol sağlartional aktivasyonu. Bu tekniğin güvenilir ifade seviyelerini üretirken, ilgi her gen bir öldürme eğrisi kalibrasyonu, hücre kolonilerinin seçimi ve genel olarak daha fazla kaynak da dahil olmak üzere vasıflı iş bir kaç hafta gerektirir. Burada iyon kanalı analizinde gerekli kontrollü bir şekilde bir proteini ifade etmek için etkili bir yol olarak indüklenebilir bir sistemde geçici reseptör potansiyel katyon kanalı alt ailesi V 1 (TRPV1) geninin geçici transfeksiyon kullanan bir protokol mevcut. Biz bu tekniği kullanarak, bir tek transfeksiyon ile veri toplama her türü için gerekli olan kontrollü kanal seviyeleri ile kalsiyum görüntüleme, tüm hücre ve tek kanallı analizi gerçekleştirmek mümkün olduğunu göstermektedir. Genel olarak, bu iyon kanalları yapı ve fonksiyon çalışma için kullanılabilir kopyalanabilir bir teknik sağlamaktadır.

Giriş

Heterolog sistemleri ifade hücresel fonksiyonları ¹ çok sayıda çalışma için en yaygın kullanılan tekniklerden biridir. Onların düşük endojen protein profili, asgari bakım gereksinimleri, güvenilir büyüme ve yabancı DNA'yı almak ve ifade yeteneği, insan embriyonik böbrek (HEK293) ve biyolojik araştırmaların ^{2, 3} neredeyse temel Çin Hamster Yumurtalık (CHO) gibi hücre hatları yaptık. heterolog sistemler kullanılarak çalışma alanları zar proteinleri, hücre içi sinyal ve enzimatik aktivite içerir. Hücreye yabancı DNA'nın transfeksiyonu takiben, analiz, birçok farklı formları elektrofizyoloji, rasyometrik kalsiyum görüntüleme, western blot, vb ^{4, 5} de dahil olmak üzere, yapılabilmektedir.

heterolog sentezleme sistemleri için potansiyel uygulamalar geniş bir dizi için birçok differe nedeniylent reaktifler ve ürünleri bu hücreler ve nitelikleri ⁶ kullanmak için geliştirilmiştir. geçici veya kalıcı olarak eksojen proteini incelemek için hücre içine yabancı DNA'yı entegre DNA verme sistemleri, biyolojik araştırmalar için en popüler ve kullanışlı araçlarından biri haline gelmiştir. Daha özel olarak ise, bir hücre içine geçici olarak transfekte DNA, yaygın olarak nispeten daha az bir zaman ve malzeme gerektiren, basit ve yalındır işlem olarak kullanılır. Ayrıca, transfeksiyon geçmesi hücrelerin başarı oranı ⁷ yüksektir. Bu teknik, aynı şekilde yeşil floresan proteini (GFP) gibi bir işaretleyici gen ile birlikte ve örneğin kalsiyum görüntüleme ve elektrofizyoloji ⁵ gibi birçok farklı teknikleri için kullanılabilir zaman çok güvenilirdir. Ne yazık ki, olsa da, geçici konakçı hücreler içine DNA ifade etmeyen hücre başına ekspresyon seviyesi güvenilmez olduğunu en az, bazı önemli tuzaklar ile birlikte geliyor. plazmid DNA kopya sayısı u alınmışhücre başına p böylece bireysel deneyler arasındaki ifade çok ² değişebilir, kontrol edilemez. Ya fizyolojik koşulları çoğaltmak için çalışıyoruz, ya da kesin veri toplama tekniklerini yaparken bu sorun önemli hale gelir.

Tek sağlanması ilgilenilen bir gen gibi bir tetrasiklin bastırıcı sentezleme sistemi gibi bir uyarımlı promotör, sıkı kontrol altında bir hücrenin genomu içine sokulabilir olan, kararlı transfeksiyon protokolleri tasarlanmıştır yukarıda bahsedilen komplikasyonların bir çözüm olarak, plazmidin kopyalama her bir hücrenin genomu içinde entegre olması ve yalnızca doksisiklinin varlığında, örneğin, transkripsiyon mekanizmasının indüksiyonundan sonra eksprese edilir. Bu tutarsızlık, protein sentezleme seviyeleri engeller çözer birlikte, bu yöntem, geçici transfeksiyonlar hızlı ve nispeten basit bir protokol uygun kaybeder. stabil bir hücre dizisi oluşturulması yüklenebileceğini en az bir kaç hafta sürerh bir protein ifadesini korumak ve vektör entegrasyonunu sağlamak ve ustaca seçin ve hücre kolonilerini büyümeye özel antibiyotik tarafından belirlenen bir öldürme eğrisini kalibre gerekir. Genel olarak bu alt başarı oranı ⁸ ile önemli ölçüde daha fazla zaman ve çaba gerektirir.

Burada, herhangi bir uyarılabilir hücre hattında ifade seviyelerini kontrol etmek için basit ve etkili bir şekilde sağlamak için popüler transfeksiyon seçeneklerinin her ikisi de güçlü üzerine çekiyor bir ara protokol tanıtmak. indüklenebilir bir tet sistemi hücreleri muhafaza ederken, geçici olarak homolog represör sistemi ile kombine bir vektör içine lige ilgi Gen, geçici reseptör potansiyel katyon kanalı alt ailesi V 1 (TRPV1), transfekte. Bu şekilde, bir gen ifade etmek başlayan olmayan hücrelere dahil edilebilir. Sadece doksisiklin ilavesi ile gen protein İfade seviyelerini kalibre etmek bize izin verdiği ifade başlar yokFizyolojik koşullarda gözlenen teknik veya düzeylerine göre Ession. Bizim protokol, aynı zamanda, bir stabil şekilde eksprese eden hücre çizgisi üreten bağlantılı uzun komplikasyonlar önlenir. Biz kalsiyum görüntülemede TRPV1 aktivasyon değişen düzeylerde göstererek başlar un kaynaklı indüksiyon ve nasıl hücre içi kalsiyum seviyesinin yükselmesi ilişkilidir dört saat boyunca. Daha sonra indüksiyon süresinin artması ile artmaktadır akımını gösteren Patch kenetleme tekniğinin tüm hücre konfigürasyonunda protokolü çoğaltmak. Son olarak, tek kanallı elektrofizyoloji kayıtların örnekler sunmakta ve proteinin tek tek birimler göre hassas veri toplama ararken bu teknik kontrollü sentezlenmesi için özellikle yararlı olduğu gösterilmiştir. böylece deneyler sağlamak ve mo arasındaki koşullarını kontrol etmek için bir yol sağlayarak, uzun hücre kültürü komplikasyonları kaçınırken bizim protokolü sayesinde, heterolog sistemlerde protein ifadesini kontrol etmek için uygun bir yol sunartekrarlanabilir sonuçlar yeniden.

Protokol

1. Vektör Baskılanabilir Site içine İlgi Gene bağlanması

1. / TO gibi pcDNA5 / FRT / TO veya pcDNA4 olarak bir aşılanabilir vektör edinin.
2. Siliko DNA analiz yazılımı ⁴ ile aynı zamanda seçilen vektörünün çok sayıda klonlama bölgesi yer almaktadır genin ortasında potansiyel olarak duyarlı restriksiyon siteleri için ilgi konusu geni analiz edin.
3. Kullanma bindirici PCR teknikleri ^4, (ilgili genin içinde bulunmayan) seçilen iki sınırlama enzimi tanıma mevkileri ile ilgili geni başlangıç kodonundan önce yerleştirilmiş birinci ve durdurma kodonundan sonra ikinci kanat.
4. vektör hem Digest ve öz önlemek için, sadece 30 dakika boyunca vektörü reaksiyonuna bir birim dana bağırsağı fosfatazı (CİP) ilave edilir, bir saat boyunca enzimlerin çalışma sıcaklığında, önceki (adım 1.2 seçilen) restriksiyon enzimleri ile ekleme ligasyon.
5. Bir% 1 agaroz jeli üzerine sindirilmiş DNA yükleyin ve elektroforez ⁹ parçalanabilen segmentleri ayırın.
6. UV ışığı ile, bir bıçak ile vektörün istenen bölümleri içeren jel parçaları kesilmiş ve lige edilmesi yerleştirin.
7. (Ticari mevcut DNA ekstraksiyon kitleri kullanılarak) agaroz jel parçalarından DNA parçalarını Özü ve 260 nm'de spektrofotometre ile nihai konsantrasyonu ölçmek.
8. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında T4 ligaz enzimi kullanılarak uyarılabilir seçilen vektör içine ilgili geni Arter. insertin 1 mol oranı l: vektör inserti vektörü ile bağlanması olasılığını artırmak amacıyla bir 3 kullanın. Kontrol için, sadece vektör içeren bir ligasyon reaksiyonu hazırlar.
9. Bakteriyel transformasyon için, 50 uL E.coli içine, tek başına vektör ve vektör + geni 10 ng ekleyin. 42 ° C'de 45 saniye kuluçkaya bırakma takip 30 dakika boyunca buz üzerinde tüp inkübe edin. Hemen geri koyunİki dakika boyunca buz üzerinde ve 500 uL LB ortamında dönüştürülmüş bakteri aktarın. 220 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de bir saat süreyle inkübe edilir.
10. Başarılı bir şekilde transforme edilmiş bakterilerin seçimi için, uygun bir antibiyotiği içeren bir hazır LB agar plakası üzerinde (1.9 de tarif edildiği gibi), her bir reaksiyonun plakası 100 uL (örneğin, 100 ug / ml ampisilin pCDNA4 / TR kullanarak).
11. 37 ° C'de gece boyunca büyümeye olanak sağlar. Plakalar sıkıca plastik parafın film sarılarak iki haftaya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
12. 10 uL ucunu kullanarak ayrı ayrı koloniler kaldırın ve 220 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de + Antibiyotik Orta 3 ml LB, gece boyunca büyümeye olanak sağlar. ilgi DNA Bakteriler dondurulabilir (-20 ° C) 11.000 xg'de LB ve bakteri santrifüj ve süpernatant dışarı aspire kısa süreli depolama için. Uzun süreli depolama -80 ° C'de gliserol stoklan halinde bakteri dondurma gerektirir.
13. throu DNA Özügh mini hazırlık ve 260 nm ⁵ de spektrofotometre ile nihai konsantrasyonu ölçmek.
14. Saflaştırılmış yapı ⁴ sıralanmasıyla ilgi konusu genin başarıyla girilmesi kontrol edin. Seçenek olarak ise, bir kısıtlama kesim parçalarını ayırmak ve varlığını değerlendirmek için elektroforez ile enzim ve uzunluğu yapının tanısal sindirimi bu son ⁴ yararlanılabilir.

TetR ifade 2. Kültürleme Hücre Hatları

1. kendi genomik DNA içine dahil bir tet plazmid bir hücre kültürü hattı elde edilir. Burada protokol bir örnek olarak pcDNA6 / TR plazmid İnsan embriyonik böbrek 293T hücreleri (HEK-293T) kullanılarak yazılır.
2. Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM), 100 mm doku kültürü plakasında tohum hücreleri,% 10 FBS ile takviye edilmiş,% 1 Penisilin-Streptomisin, 2 mM L-glutamin, ve 25 mM HEPES (burada: Tam DMEM), pH 7.3 ve O inkübe 37 / N# 176; C ve% 5 CO _2. hücrelerle bütün çalışmalar, steril koşullar altında, bir biyolojik başlık yapılmalıdır.
3. Tet represör genin ifadesinin muhafaza ortamı aspire ve 5 mg / ml Blasticidin ile desteklenmiş tam DMEM ile değiştirmek için. 37 ° C'de ve% 5 _CO2 hücreleri inkübe edin.
4. Hücreler 80 ulaştıklarında -% 90 oranında konfluent, orta aspire ve yavaşça (kalsiyum ve magnezyum içermeyen) DPBS ile iki kez yıkama hücreleri, 37 ° C'ye kadar ısıtıldı.
5. yavaşça, mekanik zarar vermeden hücre asansör DMEM,% 0.05 tripsin içeren kültür inkübe etmek için 1.5 dakika boyunca 37 ° C'de ısıtıldı.
6. Tam DMEM eşit hacimde tripsin eylemini bloke. Yavaşça yukarı pipet ve aşağı hücreleri kaldırın ve steril bir tüpe aktarmak için.
7. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin hücreleri.
8. Süpernatantı aspire ve 1 mL Tam DMEM ile değiştirin. Hiçbir kadar yukarı ve aşağı hücreleri ile çözüm pipetlehücre kümeleri görülebilir. Kont ve hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısını hesaplamak.
9. Tohum 1-2 x 10 5 mg / ml Blasticidin 12 ml tam DMEM içeren 100 mm doku kültürü çanağı içinde ⁶ hücre. onlar% 90 confluency ulaşmak olarak haftada iki kez hücreleri bölün.

3. Hücreleri içinde ilgili plazmid transfekte

1. 0.9 ml tam DMEM ile hazırlanan bir 12-çukurlu plaka içindeki yuvalara yukarıda transferi hücreleri tarif edildiği gibi ayırma hücrelerin aynı yöntemi kullanarak, yeterli% 50 konfluent (~ 200,000 hücre) yapmak ve bir _CO2, 37 ° C de bir gece boyunca inkübe etmek inkübatör.
2. pcDNA4 bir transfeksiyon karışımı hazırlayın / ilgili geni içeren inert bir plazmid nihai hacim 100 ul olmak için (gerekirse) 1 ug, 3 uL lipit transfeksiyon reaktifı ve DMEM toplam DNA miktarı getirmek. Farklı proteinler farklı etkinlik ifade olarak kullanılmak üzere plasmid DNA optimal miktarı çok değişkendir. Elektronik içinrophysiological deneyleri, başarılı bir şekilde transfeksiyon ⁴ geçiren hücreler görselleştirmek için transfeksiyon kokteyl memeli sentezleme plasmidi EGFP bulunmaktadır.
3. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında transfeksiyon karışımı inkübe edin.
4. 12 oyuklu plaka hücreler üzerine damla damla transfeksiyon karışımı pipetleme hücreleri transfekte DNA ve transfeksiyon reaktifi homojen bir dağılım sağlamak için kuvvetli bir şekilde plaka sallayın. Hücreler ~ transfeksiyon zamanı% 80 konfluent olmalıdır.
5. 37 ° C 'de transfekte edilmiş hücrelerin O / N inkübe ve% 5 _CO2.
6. Hücreler başarıyla elektrofizyoloji performans ise ertesi sabah UV lamba altında EGFP floresan sinyalini gözlemleyerek transfekte olduğunu onaylayın.

Poly-D-Lizin (PDL) 4. Kaplama Hücreler Lameller / Wells

1. % 70 izopropil etanol çözeltisi ile dousing 12 mm lamelleri sterilize edin. Kuru ve tek coversl koyunelektrofizyolojik kayıt için 24 oyuklu bir plakanın her bir IP.
2. Bir kalsiyum görüntüleme odasının her lamel veya oyuk üzerine 0.2 mg / ml PDL çözeltisi - 0.1 bir çözelti pipetle.
3. % 5 _CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 30 dakika boyunca bekletin.
4. Her yıkama arasında aspire, hücre kültürü dereceli çift damıtılmış su (DDW) ile üç kez yıkanır. Nihai yıkamayı takiben, iyice kurumasını ve oda sıcaklığında bekletin.
5. Elektrofizyoloji, 37 ° C'ye kadar ısıtıldı, 500 uL tam DMEM ile her bir içeren bir PDL kaplı lamel doldurun.
6. yukarıda tarif edildiği gibi transfekte edilmiş hücreleri bölme aynı yöntemi gerçekleştirmek. elektrofizyoloji kayıt için her PDL kaplı lamel merkezine tripsin tedavisi ve engelleme, transfer hücreleri (veya yaklaşık 30.000 hücreleri) 80 ul aşağıdaki hücrelerin resuspending sonra. Hücreler en az 1.5 saat için oturuşmaya veya% 5 _CO2 inkübatöründe 37 ° C'de gece boyunca inkübe izin verin.
7. her bir PDL kaplı kalsiyum görüntüleme merkezine hücrelerinin kalsiyum görüntüleme transferi ve nokta 20 uL (yaklaşık 20.000 hücreleri) için. Hücrelerin en az 30 dakika süreyle yerleşmek ve her bir kuyu için 180 mcL tam DMEM eklemek için izin ver.

5. Endükleyen Gen İfadesi

1. üreticinin talimatlarına uygun olarak DDW içinde 1 mg / mL'lik bir doksisiklin stok çözelti hazırlayın. 3 hafta boyunca 4 ° C'de ışıktan korunmuş olarak stok solüsyonu tutun. Uzun süreli depolama için -20 ° C'de doksisiklin stok solüsyonu tutun.
2. Tam DMEM taze 2 ug / ml (elektrofizyoloji) ya da 3 | ig / ml (kalsiyum görüntüleme) doksisiklin çözeltisi hazırlayın ve 37 ° C'ye ısıtınız.
3. Elektrofizyolojik kayıtlar, pipet için her / ml doksisiklin solüsyon 2 ug 500 uL de 1 ug / ml doksisiklin bir son konsantrasyon yapmak. kalsiyum görüntüleme için, nihai konsantrasyonunun yapmak için her bir oyuğa 3 ug / ml doksisiklin çözeltisi 100 mcL1 mcg / ml doksisiklin yon. indüksiyon saat yazınız.
4. İstenen 37 ° C 'de indüksiyonu için süreyi ve% 5 _CO2 inkübe edin.

Protein İfade 6. Kalibre Timeline

1. Kalsiyum Görüntüleme ^{5, 10} ile protein ifadesini kalibre
   1. Ringer çözeltisi (140 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 1.8 mM _CaCl2, 2 mM NaOH ile 7.4'e ayarlanmıştır MgSO _4, 20 mM Hepes, pH) ve sıcak 37 ° C hazırlayın.
   2. Ringer çözeltisi kanal agonistinin doyurucu konsantrasyonlarının hazırlayın. hücreler ve hücre dışı solüsyon içeren kalsiyum görüntüleme bölmelere ilave edildiğinde agonist miktarı seyreltilir için, agonist, istenen son konsantrasyona miktarını iki katına. Bu aynı zamanda kontrol etmek için her bir kritik banyo çözeltisinin miktarını sağlar.
   3. D iyonik olmayan F-127 20% W / V bir çözelti hazırlayınMSO. iyonik olmayan, F-127 çözünene kadar 40 ° C çözelti ısıtılır. Oda sıcaklığında, iyonik olmayan, F-127 çözeltisi, depolama ve kullanma öncesi 40 ° C'ye ısıtın. İyonik olmayan F-127 gibi Fura-2 sulu çözeltiler içinde floresan iyon göstergelerin asetoksimetil (AM) esterleri dağıtmak yardımcı olmak için kullanılır.
   4. Kültür ortamı basınçla, Fura-2AM yükleme çözeltisi ile değiştirin (2 ile takviye edilmiş Ringer çözeltisi - 3 uM Fura-2AM, 0.02 mg / ml non-iyonik, F-127 ve 10 mM D-glukoz).
   5. karanlıkta, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca inkübe edin.
   6. Ringer + 10 mM D-glukoz solüsyonu ile aspire Fura-02:00 çözümü ve yıkama hücreleri dışı boya kaldırmak için. İki kez bu adımı yineleyin.
   7. her bir 200 uL Ringer, 10 mM D-glikoz çözeltisi boş ve karanlıkta, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir.
   8. mikroskop burun parçasının üstünde sahnede odasına yerleştirin ve tutucu ile sabitleyin.
   9. lamba, kamera ve mikroskop açın ve 510 nm wav de emisyon tespit etmek için Fura-2 filtre seçinelength.
   10. İstenilen büyütme için ayarlayın ve seçilen alanda hücreleri odaklanır.
   11. karanlıkta arka plan ışığı çıkarmak ve pozlama süresi ayarlayın.
   12. 340 ve 380 nm dalga boylarında heyecanlı onlar tarafından Fura-2 yüklü hücreler istenilen hızı ve kayıt floresan tepkisi Set resim örnekleme. 340/380 sinyallerinin oranı TRPV1 faaliyeti dolayısıyla da bir hücre içi Ca2 ⁺ konsantrasyonu için gösterge ve olduğunu.
   13. TRPV1 ifade seviyesini değerlendirmek için 1 uM kapsaisin nihai bir doyma konsantrasyonu oluşturmak için pipetleme 200 uL Ringer çözeltisi içinde 2 uM kapsaisin ekleyin.
   14. indüksiyon zamana göre TRPV1 yanıtını Analiz ve ilgi protein için protokol belirler.
2. Yama kelepçe tekniğiyle ^{4, 11,} bütün hücre konfigürasyonu kullanılarak heterolog sistemlerde protein ifadesini ayarlanması.
   1. t hazırlayınO NaOH ile pH 7.4'e ayarlandı (mM) 140 NaCl, 2.3 KCl, 2 MgSO _4, 5 HEPES ve 5 2- (N-morfolino) etansülfonik asit (MES), bir çözelti banyosu.
   2. hücre dışı çözelti içinde kanal agonistinin doyurucu konsantrasyonlarının hazırlayın.
   3. 4 MQ - 2 bir direnç bir iç çapı 1.10 mm (ID) ve yangın cila ile cam elektrotlar çekin.
   4. (MM) 130 KCI, 4 NaCI, bir pipet çözeltisi hazırlayın MgSO ₄ 2, 0.5 _CaCl2, 1, EGTA ve 10 HEPES, KOH ile pH 7.2 değerine ayarlanır. Kullanmadan önce pipet çözüm Filtre. Her deneyden önce, tek bir yangın parlatılmış cam pipet geri en az bir dakika pipet çözüm ucu daldırarak doldurulur ve daha sonra aynı pipet çözeltisi ile dolu bir şırınga ile erimiş ve gergin ucunu kullanarak doldurulur.
   5. Yavaşça oda sıcaklığında yaklaşık 2 mL banyo çözeltisi ile doldurulmuş 35 mm plastik petri de kaplanan hücreler, tek bir PDL kaplı lamel kaldırın. Bir ep altında gözlemlemeki-floresan mikroskop.
   6. epifluorescent mikroskop ile görüntülendi olarak hazırlanan lamel, bir EGFP pozitif hücre bulun ve görüntülenmiştir alanın merkezine taşıyın.
   7. Mikromanipülatör pipet tutucu dolu pipet takın ve hücre içi pipet çözüm kirlenmesini önlemek için sisteme pozitif basınç küçük bir miktar enjekte edin. sadece GFP Yukarıda indirin - pozitif hücre, düzgün direnç kontrol.
   8. Pipet hücre temas zamanda, bir cam pipet ve hücre membranı arasında bir GΩ mühür oluşturmak üzere negatif basıncın bir miktar uygulanır.
   9. emme kısa keskin darbe ile, pipet hücrenin hücre içeriği ile temas sağlayan hücre zarı bölünürler.
   10. sırasıyla, 5 kHz ve 0.5α - tüm hücreye amplifikatör moduna geçmek ve 1 ila Bessel filtre ve çıkış kazancını indirin.
   11. doyurma için geçerli cevabı kaydedinGerilim rampaları veya boşluk serbest protokolünü kullanarak kanal agonist konsantrasyonları.
   12. ifade verimlilikleri farklı proteinler arasında değiştiği için, farklı indüksiyon uzunluğu süreleri kullanarak kayıtları tekrarlayın.
3. Tek kanallı kayıtları ⁴ için ideal bir indüksiyon süresi belirlenmesi.
   1. Bir pipet çözeltisi olarak, NaOH ile pH 7.4'e ayarlandı (mm) 150, Na-glukonat, 15 NaCl, 5 EGTA, 10 HEPES, içeren bir çözelti hazırlayın. banyo çözüm için adım 6.2.1 den çözümü kullanın.
   2. ID 0.86 mm cam pipetler 10 kadar direnç yangın cilalı kullanarak tüm hücre prosedürü tekrarlayın - 12 MQ ve mV -40 potansiyeli tutarak ayarlayın.
   3. daha önce açıklanan ve membran rüptür olarak membran üzerinde bir mühür oluşturun.
   4. Mikromanipülatör kullanarak, uzak hücreden membran yama ile pipet kaldırın.
   5. membran yama içeren pipet doğrudan bir sonraki perfüzyon sistemi yerleştirin.
   6. daha düşük Tsırasıyla, 5 kHz ve 10a skoru 2 - filtre ve çıkış kazancını Vladislav Tkachiev: Bessel.
   7. Yama yanıtına göre, bir ya da daha fazla kanal içeriyorsa, membran yama üzerinde agonist doyurucu konsantrasyonlarının değerlendirilmesi serpmek.
   8. başarıyla hücrelere uygulanan indüksiyon zamana karşı kaydedilen tek kanallı yamalar sayısını analiz edin. istenen sonuçlara göre endüksiyon süresini ayarlayın.

Sonuçlar

Hızlı bir şekilde uyarılabilir ifade modeli oluşturmak için, biz tetrasiklin bastırıcı protein (TR) ifade eden HEK293 hücrelerine kullandı (örneğin, T-Rex-293) ve CMV promoter ve çoklu klonlama sitesi arasında tetrasiklin operatör dizileri (TETO) ihtiva vektörleri (örneğin, pcDNA4 / TO). TRex-293 hücreleri içine transfekte edilmiş zaman TR teto bağlanan gibi, pcDNA4 / TO daki genin ekspresyonu, bastırılır. orta doksisiklin eklenmesi, böylece t...

Tartışmalar

Transfeksiyon ifade tutarlılığı ve istikrarı geliştirmek için birçok farklı varyasyonları ile protein ekspresyonu ve araştırma için yaygın olarak kullanılan bir protokoldür. Geçici transfeksiyon ayıraçları kolay, basit bir ilgi hücre ve protein transfeksiyon zaman gecede saat içinde analiz edilebilir protokolünü kullanmak için sunuyoruz. Analiz modu gibi elektrofizyoloji ² tek kanallı kayıtları gibi protein ifadesi, tutarlı bir düzeyde gerektirir Ne yazık ki bu yakl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V102020
pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V103320
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Swift™ MaxPro Thermal Cycler	Esco	n.a
Restriction Enzymes	ThermoScientific Fisher	ER0501
Agarose	Lonza	50004
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012
NanoDrop 2000c	ThermoScientific Fisher	ND-2000C
T4 DNA Ligase	ThermoScientific Fisher	EL0011
One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli	ThermoScientific Fisher	C404006
Ampicillin (Sodium), USP Grade	Gold Bio	A-301-5
Tryptone for microbiology	Merck	6.19305E+13
Yeast Extract	BD worldwide	212750
SIF6000R Incubated Shaker	LAB COMPANION	45H118
NucleoSpin®plasmid	Macherey Nagel	740588.25
MS 300V Power Supply	Major Science	MP-300V
Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System	ThermoScientific Fisher	B1A
T-REx™-293 cell line	Invitrogen	R710-07
DMEM (1X), liquid (high glucose)	Gibco	41965-039
HindIII-HF®	NEB	R3104S
ApaI	NEB	R0114S
CutSmart® Buffer	NEB	B7204S
pcDNA™6/TR  Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V102520
Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin	Gibco	10270106
HEPES Buffer Solution (1 M)	Biological Industries	03-025-1B
Penicillin-Streptomycin Solution	Biological Industries	03-031-1B
L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM)	Biological Industries	03-022-1B
Heracell™ 150i CO2 Incubator	ThermoScientific Fisher	51026406
MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet	ThermoScientific Fisher	51025411
Blasticidine S hydrochloride	Sigma-Aldrich	15205-25MG
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Modified, without calcium chloride and magnesium chloride	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
DOUBLE NEUBAUER RULED METALLIZED HEMACYTOMETER	Hausser Scientific	31000
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
TransIT®-LT1 Transfection Reagent	Mirus	MIR 2300
glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round	Knittel Glass	GG-12
BioCoat™ Poly-D-Lysine	Corning	354210
Water, Cell Culture Grade	Biological Industries	03-055-1A
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-1G
Fura-2, AM ester	Biotium	BTM-50034
Pluronic® F-127	Sigma-Aldrich	P2443-250G
µ-Slide 8 Well	ibidi	80826
(E)-Capsaicin	Tocris	462
Olympus IX70 Fluorescence Microscope	Olympus	n.a
Lambda DG-4 Wavelength Switcher	Sutter Instruments	n.a
EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera	QImaging	n.a
MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software	Molecular Devices	n.a
Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-110-7.5HP
Standard Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-7.5HP
Dimethyl sulfoxide anhydrous	Sigma-Aldrich	276855
P1000 micropipette puller	Sutter Instruments	P-1000
MF-900 Microforge	NARISHIGE	n.a
ValveBank perfusion sysytem	AutoMate Scientific
Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System	Molecular Devices	n.a
Axopatch 200B Amplifier	Molecular Devices	n.a
pCLAMP 10.6 Software	Molecular Devices	n.a
micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225