Contrôlable Expression Ion canal par transfection transitoire inductible

Résumé

Étudier les canaux ioniques à travers un système exprimant de manière hétérologue est devenue une technique de base dans la recherche biomédicale. Dans ce manuscrit, nous présentons une méthode efficace de temps pour obtenir l'expression du canal ionique étroitement contrôlé en effectuant une transfection transitoire sous le contrôle d'un promoteur inductible.

Résumé

La transfection, la délivrance d'acides nucléiques étrangers dans une cellule, est un puissant outil pour la recherche de protéines. Grâce à cette méthode, les canaux ioniques peuvent être étudiés par analyse électrophysiologique, la caractérisation biochimique, des études mutationnelles et leurs effets sur les processus cellulaires. Des transfections transitoires proposent un protocole simple dans lequel la protéine est disponible pour l'analyse au bout de quelques heures à quelques jours. Bien que cette méthode présente un protocole efficace relativement simple et le temps, l'un des éléments essentiels est l'étalonnage de l'expression du gène d'intérêt à des niveaux pertinents physiologiques ou des niveaux qui sont adaptés à l'analyse. A cet effet, de nombreuses approches différentes qui offrent la possibilité de contrôler l'expression du gène d'intérêt sont apparus. Plusieurs protocoles de transfection de cellules stables constituent un moyen d'introduire de façon permanente un gène d'intérêt dans le génome cellulaire sous la régulation d'une transcriptase tétracycline contrôléeactivation tional. Bien que cette technique produit des niveaux d'expression fiables, chaque gène d'intérêt nécessite quelques semaines de travail qualifié y compris l'étalonnage d'une courbe de mise à mort, la sélection des colonies de cellules, et dans l'ensemble plus de ressources. Ici, nous présentons un protocole utilisant une transfection transitoire de l'élément de potentiel sous-famille V du canal de cation 1 (TRPV1), le gène transitoire de récepteur dans un système inductible comme un moyen efficace pour exprimer une protéine de manière contrôlée ce qui est essentiel dans l'analyse du canal ionique. Nous démontrons que l'utilisation de cette technique, nous sommes en mesure d'effectuer l'imagerie calcique, cellules entières, et l'analyse de canal unique avec des niveaux de canaux contrôlés requis pour chaque type de collecte de données avec une seule transfection. Dans l'ensemble, cela fournit une technique réplicable qui peut être utilisée pour étudier les canaux ioniques structure et fonction.

Introduction

Systèmes exprimant hétérologue est l' une des techniques les plus couramment utilisées pour étudier une multitude de fonctions cellulaires ^1. Leur faible profil endogène des protéines, un minimum d'entretien, la croissance fiable, et la capacité de prendre et d' exprimer l' ADN étranger ont fait des lignées cellulaires telles que rein embryonnaire humain (HEK293) et ovaire de hamster chinois (CHO) presque indispensable à la recherche biologique ^{2, 3.} Les domaines de recherche en utilisant des systèmes hétérologues comprennent des protéines membranaires, la signalisation intracellulaire, et l'activité enzymatique. Après la transfection d'ADN étranger dans la cellule, de nombreuses formes différentes d'analyse peuvent être effectués, y compris l' électrophysiologie, l' imagerie calcique ratiométrique, western blot, etc. ^{4, 5.}

En raison de la vaste gamme d'applications potentielles pour les systèmes d'expression hétérologues, beaucoup différedes réactifs et des produits nt ont été développés pour utiliser ces cellules et leurs qualités ^6. systèmes de délivrance d'ADN qui transitoirement ou définitivement intégrer l'ADN étranger dans des cellules pour étudier la protéine exogène est devenu l'un des outils les plus populaires et utiles pour la recherche biologique. Plus précisément, la transfection transitoire d'ADN dans une cellule est largement utilisé comme un processus simple et directe qui nécessite relativement peu de temps et de matériaux. En outre, le taux de succès des cellules qui subissent une transfection ⁷ est élevée. Cette technique est très fiable lorsqu'elle est associée à un gène marqueur tel que la protéine fluorescente verte (GFP), et peut être utilisé pour de nombreuses techniques différentes telles que l' imagerie du calcium et ⁵ électrophysiologie. Malheureusement, cependant, exprimant de manière transitoire l'ADN dans des cellules hôtes est livré avec quelques écueils majeurs, pas le moins que le niveau d'expression par cellule est peu fiable. Le nombre de copies d'ADN de plasmide prise up par cellule est incontrôlable, donc l'expression entre les expériences individuelles peut varier considérablement ^2. Cette question devient importante lorsque l'essayer de reproduire les conditions physiologiques, ou d'effectuer des techniques de collecte de données précises.

En tant que solution aux complications mentionnées ci-dessus, des protocoles de transfection stables ont été conçues dans lesquelles un gène d'intérêt peut être inséré dans le génome d'une cellule sous le contrôle étroit d'un promoteur inductible, tel qu'un système de tetracycline répresseur de l'expression, assurant une seule copie du plasmide intègre dans le génome de chaque cellule et est exprimé uniquement après l'induction du mécanisme de transcription, par exemple, en présence de doxycycline. Bien que cela résout les obstacles de niveaux d'expression de protéines incompatibles, cette méthode perd la commodité du protocole rapide et relativement simple de transfections transitoires. L'établissement d'une lignée cellulaire stable prend au moins quelques semaines à which on doit étalonner une courbe de mise à mort fixé par des antibiotiques spécifiques pour maintenir l'expression de protéines et d'assurer l'intégration du vecteur et habilement sélectionner et cultiver des colonies de cellules. Dans l' ensemble cela prend beaucoup plus de temps et d' effort avec un taux de réussite inférieur ^8.

Ici, nous présentons un protocole intermédiaire qui appuie sur les points forts des deux options de transfection populaires pour fournir un moyen simple et efficace pour contrôler les niveaux d'expression dans toute lignée cellulaire inductible. Tout en conservant les cellules avec un système Tet inductible, nous transfecter transitoirement notre gène d'intérêt, le récepteur transitoire canal cationique sous-famille V membre potentiel 1 (TRPV1), ligaturé dans un vecteur qui peut se combiner avec l'homologue système répresseur. De cette manière, le gène peut être introduit dans les cellules sans commencer à exprimer. Seulement avec l'ajout de doxycycline ne le gène commence à exprimer, ce qui nous permet d'étalonner les niveaux de protéines expression selon la technique ou à des niveaux observés dans des conditions physiologiques. Notre protocole permet également d'éviter de longues complications associées à la génération d'une lignée cellulaire exprimant de manière stable. Nous commençons par montrer l'évolution des niveaux d'activation de TRPV1 en imagerie de calcium à travers quatre heures d'induction et comment la hausse des taux de calcium intracellulaire est corrélée induite non. Nous avons ensuite dupliquer le protocole dans la configuration cellule entière de la technique du patch clamp, montrant le courant augmente avec le temps de l'induction de plus en plus. Enfin, nous présentons des exemples d'enregistrements individuels d'électrophysiologie de canal, et de montrer que cette technique est particulièrement utile pour l'expression contrôlée lors de la recherche pour la collecte de données précises sur la base de différentes unités de la protéine. Grâce à notre protocole, nous offrons un moyen pratique pour contrôler l'expression des protéines dans des systèmes hétérologues, tout en évitant de longues complications de culture cellulaire, fournissant ainsi un moyen de contrôler les conditions entre les expériences et fournir des more des résultats reproductibles.

Protocole

1. ligaturer le gène d'intérêt dans le site répressible de Vector

1. Obtenir un vecteur inductible tel que pcDNA5 / FRT / TO ou pcDNA4 / TO.
2. Analyser le gène d'intérêt pour tous les sites de restriction potentiellement sensibles dans le milieu du gène qui sont également dans le site de clonage multiple du vecteur choisi par un logiciel d'analyse d'ADN silico ^4.
3. Des techniques utilisant de chevauchement PCR standard ^4, flanquent le gène d'intérêt avec les deux sites de reconnaissance d'enzymes de restriction choisies (qui ne figurent pas dans le gène d'intérêt), le premier inséré avant le codon d'initiation, et la seconde après le codon d'arrêt.
4. Digest à la fois le vecteur et l'insert avec des enzymes de restriction (choisis à l'étape 1.2), à la température de travail d'enzymes pendant une heure, suivi par l'addition d'une unité d'intestin de veau phosphatase (CIP) à la réaction de vecteur seul pendant 30 minutes, afin d'éviter l'auto- ligature.
5. Charger l'ADN digéré sur un gel d'agarose à 1% et on sépare les segments clivés par électrophorèse ^9.
6. Utilisation de la lumière UV, avec une lame les morceaux de gel contenant les segments souhaités de vecteur et d'insérer à ligaturer.
7. Extraire les segments d'ADN à partir des morceaux de gel d'agarose (en utilisant les kits d'extraction d'ADN commerciales) et de mesurer leur concentration finale par spectrophotomètre à 260 nm.
8. Ligaturer le gène d'intérêt dans le vecteur sélectionné en utilisant la ligase T4 inductible enzyme à la température ambiante pendant 20 minutes. Afin d'augmenter la probabilité de l'insert ligaturant avec le vecteur, utilisez un rapport de 3: 1 molaire de l'insert: vecteur. Pour le contrôle, préparer une réaction de ligature qui ne comprend que le vecteur.
9. Pour la transformation bactérienne, ajouter 10 ng de vecteur seul et vecteur + gène dans 50 ul compétentes E. coli. Incuber le tube sur la glace pendant 30 minutes, puis 45 secondes d'incubation à 42 ° C. Immédiatement placer dossur de la glace pendant deux minutes et transférer les bactéries transformées à 500 ul de milieu LB. Incuber pendant une heure à 37 ° C sous agitation à 220 tours par minute.
10. Pour la sélection des bactéries transformées avec succès, la plaque 100 pl de chaque réaction (comme décrit au point 1.9) sur une plaque de gélose LB préparée contenant l'antibiotique approprié (par exemple, 100 pg / ml d' ampicilline pour l'utilisation pcDNA4 / TR).
11. Laisser croître une nuit à 37 ° C. Les plaques peuvent être conservées à 4 ° C pendant jusqu'à deux semaines par bien les envelopper dans un film de paraffine plastique.
12. Soulever colonies individuelles en utilisant une pointe de 10 pi, et laisser croître pendant une nuit dans 3 ml LB + de milieu antibiotique à 37 ° C sous agitation à 220 tours par minute. Les bactéries avec de l'ADN d'intérêt peuvent être congelés (-20 ° C) pour le stockage à court terme par centrifugation de la LB et les bactéries à 11.000 xg et aspirer le surnageant. Le stockage à long terme, il faut geler les bactéries que les stocks de glycérol à -80 ° C.
13. Extraire l'ADN through mini-prep et mesurer la concentration finale par spectrophotomètre à 260 nm ^5.
14. Confirmer l' insertion réussie du gène d'intérêt par séquençage de la construction purifiée ^4. En variante, la digestion de diagnostic de la construction par des enzymes de restriction par électrophorèse pour séparer les segments de découpe et d' évaluer la présence et la longueur peut également être utilisé à cette fin ^4.

2. Lignes de culture de cellules exprimant TetR

1. Obtenir une ligne de culture de cellules hébergeant un plasmide Tet répresseur incorporé dans leur ADN génomique. Ici, le protocole sera écrit en utilisant des cellules de rein embryonnaires humaines 293T (cellules HEK-293T) hébergeant pcDNA6 / TR plasmide à titre d'exemple.
2. cellules de semences de 100 mm plaque de culture de tissu avec Eagles modifié de Dulbecco (DMEM) additionné de 10% de FBS, 1% de pénicilline-streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 25 mM de HEPES, pH 7,3 (ci-après: DMEM complet) et incuber O / N à 37 &# 176; C et 5% de CO _2. Tous les travaux avec des cellules doit être fait dans une hotte biologique dans des conditions stériles.
3. Afin de maintenir l'expression du gène répresseur Tet, aspirer le milieu et le remplacer par du DMEM complet additionné de 5 pg / ml de blasticidine. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO _2.
4. Une fois que les cellules atteignent 80-90% de confluence, aspirer le milieu et laver délicatement les cellules deux fois avec DPBS (sans calcium et magnésium) chauffé à 37 ° C.
5. Afin de soulever délicatement les cellules sans causer de dommages mécaniques, incuber la culture dans DMEM contenant 0,05% de trypsine chauffé à 37 ° C pendant 1,5 min.
6. Bloquer l'action de la trypsine avec un volume égal de Full DMEM. pipette doucement vers le haut et vers le bas afin de soulever les cellules et de les transférer dans un tube stérile.
7. Centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 min.
8. Aspirer le surnageant et le remplacer par 1 mL complet DMEM. Pipeter la solution avec les cellules vers le haut et vers le bas jusqu'à ce qu'il n'yamas cellulaires peuvent être vus. Compter et calculer le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre.
9. Semences 1 - 2 x 10 ⁶ cellules à 100 mm boîte de culture de tissu contenant 12 ml de DMEM complet avec 5 ug / ml de blasticidine. Diviser les cellules deux fois par semaine comme ils atteignent 90% de confluence.

3. transfectant le plasmide d'intérêt dans les cellules

1. En utilisant le même procédé de fractionnement de cellules , comme décrit ci - dessus, les cellules de transfert à des puits dans une plaque à 12 puits préparée avec 0,9 ml complet DMEM suffisante pour faire 50% de confluence (~ 200.000 cellules) et incuber une nuit à 37 ° C dans un CO ₂ incubateur.
2. Préparer un mélange de transfection avec pcDNA4 / TO contenant le gène d'intérêt, un plasmide inerte pour amener la quantité totale d'ADN à 1 pg (si nécessaire), 3 pi de réactif de transfection lipidique et DMEM pour rendre le volume final de 100 pi. La quantité optimale d'ADN de plasmide à utiliser varie largement différentes protéines expriment l'efficacité différente. Pour élusrophysiological expériences comprennent l' EGFP dans le plasmide d'expression mammalien dans le cocktail de transfection afin de visualiser les cellules qui subissent avec succès la transfection ^4.
3. Laisser incuber le mélange de transfection à la température ambiante pendant 30 minutes.
4. Transfecter des cellules par pipetage le mélange de transfection goutte à goutte sur les cellules ensemencées dans la plaque 12 puits et la plaque de roche vigoureusement pour assurer une dispersion homogène de l'ADN et un réactif de transfection. Les cellules doivent être ~ 80% de confluence au moment de la transfection.
5. Incuber les cellules transfectées O / N à 37 ° C et 5% de CO _2.
6. Confirmer que les cellules ont été transfectées avec succès, en observant le signal de fluorescence de l'EGFP sous la lampe UV, le lendemain matin, si l'exécution électrophysiologie.

4. Les cellules de placage sur Poly-D-Lysine (PDL) Lamelles / Wells

1. Stériliser à 12 mm avec des lamelles en aspergeant une solution d'éthanol isopropylique à 70%. Sec et placer un seul coverslip dans chaque puits d'une plaque de 24 puits pour l'enregistrement électrophysiologique.
2. Pipeter une solution de 0,1 à 0,2 mg / ml de solution PDL sur chaque lamelle couvre-objet ou bien d'une chambre d'imagerie du calcium.
3. Laisser reposer pendant 30 min à 37 ° C dans un incubateur à CO ₂ de 5%.
4. Laver avec le grade de culture cellulaire de l'eau distillée deux fois (DDW) trois fois, entre l'aspiration à chaque lavage. Après le dernier lavage, sécher et laisser reposer à température ambiante.
5. Pour électrophysiologie, remplir chaque puits contenant une lamelle revêtue PDL avec 500 ul pleine DMEM réchauffé à 37 ° C.
6. Effectuez la même méthode de diviser les cellules transfectées comme décrit ci-dessus. Après remise en suspension des cellules après traitement à la trypsine et le blocage, le transfert de 80 ul de cellules (soit environ 30 000 cellules) au centre de chaque lamelle couvre-objet revêtues de PDL pour l'enregistrement électrophysiologique. Laisser les cellules sédimenter pendant au moins 1,5 heures ou incuber une nuit à 37 ° C dans un incubateur à CO ₂ de 5%.
7. Pour le transfert du calcium d'imagerie et place 20 pi de cellules (environ 20 000 cellules) au centre de chaque image de calcium revêtu PDL puits. Laisser les cellules sédimenter pendant au moins 30 minutes et ajouter 180 ul pleine DMEM à chaque puits.

5. Induire Expression génique

1. Préparer une solution doxycycline stock de 1 mg / ml dans DDW selon les instructions du fabricant. Gardez solution stock protégé de la lumière à 4 ° C pendant 3 semaines. Pour le stockage à long terme tenir une solution de doxycycline à -20 ° C.
2. Préparer un nouveau 2 pg / mL (électrophysiologie) ou / mL (imagerie de calcium) solution de doxycycline 3 pg en Full DMEM et chauffer à 37 ° C.
3. Pour les enregistrements électrophysiologiques, la pipette 500 ul de 2 pg / ml de doxycycline solution à chaque puits pour obtenir une concentration finale de 1 pg / mL de doxycycline. Pour l'imagerie de calcium, ajouter 100 ul de 3 pg / ml de doxycycline solution de chaque puits pour effectuer une concentration finaletion de 1 pg / ml de doxycycline. Notez l'heure de l'induction.
4. Incuber pendant la durée souhaitée pour l' induction à 37 ° C et 5% de CO _2.

6. Calibrage Chronologie de l'expression des protéines

1. Calibrage expression de protéines par Imagerie calcique ^{5, 10}
   1. Préparer une solution de Ringer (NaCl 140 mM, 2,5 mM de KCl, 1,8 mM de _CaCl2, 2 mM _MgSO4, 20 mM HEPES, pH ajusté à 7,4 avec du NaOH) et chauffer à 37 ° C.
   2. Préparer des concentrations saturantes d'agoniste des canaux dans une solution de Ringer. Parce que la quantité d'agoniste est dilué quand il est ajouté à la chambre d'imagerie de calcium contenant les cellules et la solution extracellulaire, soit deux fois la quantité de la concentration finale souhaitée de l'agoniste. Cela rend également la quantité de solution de bain dans chaque puits critique à contrôler.
   3. Préparer une solution non ionique F-127 20% P / V in DMSO. Chauffer la solution à 40 ° C jusqu'à ce que la non-ionique F-127 est dissous. Conserver la solution non-ionique F-127 à TA et chauffer à 40 ° C avant utilisation. -Actif non ionique F-127 est utilisé pour aider à disperser acétoxyméthyle (AM) des esters d'indicateurs d'ions fluorescents tels que Fura-2 dans des solutions aqueuses.
   4. milieu de Aspirer et de le remplacer par une solution Fura-2 heures de chargement (la solution de Ringer complété avec 2 - 3 uM Fura-2 heures, 0,02 mg / ml non ionique F-127 et 10 mM D-glucose).
   5. Incuber pendant 60 min à température ambiante dans l'obscurité.
   6. Aspirer Fura-2AM solution et laver les cellules avec + 10 mM D-glucose de la solution de Ringer pour éliminer le colorant extracellulaire. Répéter deux fois cette étape.
   7. Laissez + 10 mM D-glucose de la solution de 200 ul Ringer dans chaque puits et incuber pendant 30 min à température ambiante dans l'obscurité.
   8. Placer la chambre sur scène au-dessus du nez pièce de microscope et le fixer avec support.
   9. Allumez la lampe, caméra et microscope et sélectionnez Fura-2 filtre pour détecter l'émission à 510 nm wavelength.
   10. Réglez le grossissement souhaité et concentrer les cellules dans le champ sélectionné.
   11. Dans l'obscurité, la lumière et soustraire fond régler le temps d'exposition.
   12. image Réglez l'échantillonnage au taux et enregistrer la fluorescence réponse souhaitée de Fura-2 cellules chargées en les excitant à 340 et 380 nm longueurs d'onde. Le rapport des signaux 340/380 est un indicateur de la concentration intracellulaire de ^{Ca2 +} et donc également une activité TRPV1.
   13. Ajouter 2 uM de capsaïcine dans une solution de 200 ul Ringer par pipetage pour créer une concentration saturante finale de 1 uM de capsaïcine afin d'évaluer le niveau de TRPV1 d'expression.
   14. Analyser la réponse TRPV1 en fonction du temps d'induction et de déterminer le protocole pour la protéine d'intérêt.
2. Ajuster l' expression de protéines hétérologues dans des systèmes utilisant la configuration de cellule entière de la technique patch-clamp ^{4, 11.}
   1. Préparer til baignent solution de (mM) 140 NaCl, 2,3 KCl, 2 MgSO _4, 5 HEPES et 5 l' acide 2- (N-morpholino) éthanesulfonique (MES), ajusté à pH 7,4 avec NaOH.
   2. Préparer des concentrations saturantes de canal agoniste en solution extracellulaire.
   3. Tirez des électrodes de verre avec un diamètre intérieur (ID) de 1,10 mm et le feu-polish à une résistance de 2-4 MQ.
   4. Préparer une solution de pipette (mM) 130 KCl, NaCl 4, 2 _MgSO4, 0,5 _CaCl2, 1 EGTA et 10 HEPES ajusté à pH 7,2 avec du KOH. Filtrer la solution de la pipette avant utilisation. Avant chaque expérience, un seul, pipette en verre poli au feu est de retour rempli en immergeant la pointe dans la solution de la pipette pendant au moins une minute, puis rempli en utilisant la pointe fondue et étirée avec une seringue remplie de la même solution de pipette.
   5. Soulevez doucement une seule lamelle revêtue PDL avec les cellules étalées du puits à un plat en plastique de Pétri de 35 mm rempli d'environ 2 ml solution de bain à la température ambiante. Observer sous un epi microscope fluorescent.
   6. Localiser une cellule positif EGFP, comme visualisés au microscope à épifluorescence, sur la lamelle préparée et se déplacer vers le centre du champ visualisé.
   7. Attacher la pipette remplie au support de pipette du micromanipulateur et injecter une petite quantité de pression positive dans le système afin d'éviter la contamination de la solution de la pipette intracellulaire. Abaisser à juste au-dessus de la GFP - cellulaire positive, la vérification de la résistance appropriée.
   8. Comme la pipette touche la cellule, appliquez une petite quantité de pression négative afin de créer un joint entre la GQ pipette en verre et la membrane cellulaire.
   9. Avec une impulsion courte, forte d'aspiration, briser la membrane cellulaire, permettant à la pipette pour entrer en contact avec le contenu intracellulaire de la cellule.
   10. Changez le mode de l'amplificateur à cellules entières, et abaisser le filtre et le gain de sortie Bessel 1 - 5 kHz et 0.5α, respectivement.
   11. Notez la réponse actuelle à l'saturanteconcentrations de canal agoniste en utilisant des rampes de tension ou de protocole sans écart.
   12. Parce que l'efficacité d'expression changent entre les différentes protéines, répéter les enregistrements en utilisant différents temps de longueur d'induction.
3. Détermination du temps d'induction idéal pour les enregistrements à canal unique ^4.
   1. Préparer une solution de (mM) 150 Na-gluconate, le 15 NaCl, 5 EGTA et 10 HEPES, pH ajusté à 7,4 avec NaOH, une solution de la pipette. Pour la solution de bain, utiliser la solution de l'étape 6.2.1.
   2. Répétez la procédure de cellules entières en utilisant ID 0,86 mm pipettes en verre poli feu à une résistance de 10-12 MQ et définir le potentiel de maintien de -40 mV.
   3. Créer un joint d'étanchéité sur la membrane comme décrit précédemment et la rupture de la membrane.
   4. Utilisation du micromanipulateur, soulevez la pipette avec le patch de membrane loin de la cellule.
   5. Positionner le système de perfusion directement à côté de la pipette contenant la pièce de membrane.
   6. Basse-til Bessel gain de filtre et de sortie à 2 - 5 kHz et 10α, respectivement.
   7. Perfuser des concentrations saturantes d'agoniste sur la pièce de membrane, en évaluant si le patch contient un ou plusieurs canaux en fonction de la réponse.
   8. Analyser le nombre de correctifs de canal unique enregistré avec succès contre le temps d'induction appliquée aux cellules. Ajuster le temps d'induction en fonction des résultats souhaités.

Résultats

Pour créer rapidement un modèle d'expression inductible, nous avons utilisé des cellules HEK293 qui expriment la protéine tétracycline répresseur (TR) (par exemple, T-REx-293) et des vecteurs qui contiennent des séquences d'opérateur de tétracycline (TetO) entre le promoteur CMV et le site de clonage multiple (par exemple, pcDNA4 / TO). Lorsqu'il est transfecté dans des cellules 293-trex, l'expression du gène d'intérêt dans pcDNA4 / TO e...

Discussion

Transfection est un protocole largement utilisé pour l'expression des protéines et de la recherche, avec de nombreuses variantes différentes pour améliorer la cohérence et la stabilité expression. réactifs de transfection transitoire offrent un moyen simple, facile à utiliser le protocole où la cellule et la protéine d'intérêt peuvent être analysés dans les heures durant la nuit à partir du moment de la transfection. Malheureusement , cette approche peut être imprévisible lorsque le mode d'a...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V102020
pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V103320
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Swift™ MaxPro Thermal Cycler	Esco	n.a
Restriction Enzymes	ThermoScientific Fisher	ER0501
Agarose	Lonza	50004
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012
NanoDrop 2000c	ThermoScientific Fisher	ND-2000C
T4 DNA Ligase	ThermoScientific Fisher	EL0011
One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli	ThermoScientific Fisher	C404006
Ampicillin (Sodium), USP Grade	Gold Bio	A-301-5
Tryptone for microbiology	Merck	6.19305E+13
Yeast Extract	BD worldwide	212750
SIF6000R Incubated Shaker	LAB COMPANION	45H118
NucleoSpin®plasmid	Macherey Nagel	740588.25
MS 300V Power Supply	Major Science	MP-300V
Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System	ThermoScientific Fisher	B1A
T-REx™-293 cell line	Invitrogen	R710-07
DMEM (1X), liquid (high glucose)	Gibco	41965-039
HindIII-HF®	NEB	R3104S
ApaI	NEB	R0114S
CutSmart® Buffer	NEB	B7204S
pcDNA™6/TR  Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V102520
Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin	Gibco	10270106
HEPES Buffer Solution (1 M)	Biological Industries	03-025-1B
Penicillin-Streptomycin Solution	Biological Industries	03-031-1B
L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM)	Biological Industries	03-022-1B
Heracell™ 150i CO2 Incubator	ThermoScientific Fisher	51026406
MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet	ThermoScientific Fisher	51025411
Blasticidine S hydrochloride	Sigma-Aldrich	15205-25MG
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Modified, without calcium chloride and magnesium chloride	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
DOUBLE NEUBAUER RULED METALLIZED HEMACYTOMETER	Hausser Scientific	31000
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
TransIT®-LT1 Transfection Reagent	Mirus	MIR 2300
glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round	Knittel Glass	GG-12
BioCoat™ Poly-D-Lysine	Corning	354210
Water, Cell Culture Grade	Biological Industries	03-055-1A
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-1G
Fura-2, AM ester	Biotium	BTM-50034
Pluronic® F-127	Sigma-Aldrich	P2443-250G
µ-Slide 8 Well	ibidi	80826
(E)-Capsaicin	Tocris	462
Olympus IX70 Fluorescence Microscope	Olympus	n.a
Lambda DG-4 Wavelength Switcher	Sutter Instruments	n.a
EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera	QImaging	n.a
MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software	Molecular Devices	n.a
Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-110-7.5HP
Standard Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-7.5HP
Dimethyl sulfoxide anhydrous	Sigma-Aldrich	276855
P1000 micropipette puller	Sutter Instruments	P-1000
MF-900 Microforge	NARISHIGE	n.a
ValveBank perfusion sysytem	AutoMate Scientific
Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System	Molecular Devices	n.a
Axopatch 200B Amplifier	Molecular Devices	n.a
pCLAMP 10.6 Software	Molecular Devices	n.a
micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225