人工程心脏组织的收缩自动分析心脏药物安全筛选

摘要

在这里，我们将展示人体工程心脏组织的产生从诱导多能干细胞（hiPSC细胞）衍生的心肌细胞。我们呈现由hERG通道抑制剂E-4031来分析收缩力和收缩图案的示例性改变的方法。这种方法显示的鲁棒性和适用性强心药物筛选的高水平。

摘要

心脏组织工程技术描述以构成三维力产生工程化组织。对于在基础研究和临床前药物开发这些程序的执行，必须制定规范条件下的自动生成和分析的协议是非常重要的。在这里，我们提出了一种技术来生成来自不同物种（大鼠，小鼠，人）的心肌细胞工程化的心脏组织（EHT）。该技术依赖于含有聚二甲基硅氧烷弹性（PDMS）柱之间解离的心肌细胞在24孔格式的血纤维蛋白凝胶的组装。三维的，力生成EHTs铸造后构成两个星期内。此过程允许每周几百EHTs的产生和在技术上由心肌细胞的可用性只有有限的（0.4-1.0×10 ⁶ / EHT）。 auxotonic肌肉收缩的评价是在修改的孵育室与mechan执行对24孔板的iCal联锁，并放置在该腔室的顶部上的照相机。软件控制了摄像机的XYZ轴系统到每个EHT上移动。 EHT收缩是由一个自动数字识别算法检测到，并且力是基于EHT的缩短和弹性倾向和几何形状的PDMS帖子的计算。该方法允许标准化并在无菌条件下高数EHT的自动分析。对心肌收缩药物效果的可靠检测心脏药物开发和安全药理学的关键。我们证明，与hERG通道抑制剂E-4031的例子，该人的EHT系统上复制人的心脏收缩动力学药物反应，这表明它是心脏药物安全性筛选一个行之有效的手段。

引言

心脏的副作用，如药物性长QT综合征导致市场撤回在过去几年里。统计数据表明，所有提款的约45％是由于心血管系统¹的不良影响。这种昂贵的发展过程和批准后药物失效是制药公司最糟糕的情况。因此，研究和开发部门重点检测的这种不良心血管作用早期。出于经济和伦理问题，努力减少动物实验，并与新的体外筛选测定代替他们正在进行中。

一组建立了试验的包括在美国食品和药物管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）为致心律失常药物作用²临床前评价的准则。体细胞重编程，随后分化的技术人类诱导多能干细胞（hiPSC细胞）推动这一研究领域^3。它现在提供了屏幕对人心肌细胞的新候选药物的可能性，并避免与物种间的差异问题。最近的心脏分化协议^4，5不提供伦理关怀心肌无限量供应。然而，收缩力，最重要的，最特征的心肌细胞的活体参数测量，没有很好地建立起来。这与人类诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（的hiPSC-CM）相比，成人心肌细胞作为相对不成熟^6。一种可能的改进是从单电池^7（工程化的心脏组织，EH....

研究方案

注意：下面的步骤描述了一种细胞培养协议。请在无菌条件下进行，并使用预热媒体。

1.的hiPSC的心脏分化

1. 培养的hiPSC
   1. 涂层6孔板（1毫升/孔）或T75烧瓶（7毫升/瓶）具有减少的生长因子基底膜基质（ 例如 geltrex，1：200;见的材料表）的Dulbecco改良的Eagle培养基中稀释（DMEM），用于在37℃下30分钟。通过混合制备FTDA介质¹²基本DMEM / F-12培养基含有2mM L-谷氨酰胺，0.5％青霉素/链霉素，5毫克/升运铁蛋白，5微克/升硒，0.1％人血清白蛋白，1×脂质混合，5 mg / L的胰岛素，50nM的dorsomorphin，2.5纳克/ ml激活素A，0.5毫微克/毫升人类TGFß1和30毫微克/毫升FGF2。
   2. 种子的hiPSC（〜3×10 ^5/10平方厘米）在FTDA培养基和培养在37℃，5％CO _{2，21％O 2，}每天更换培养基（图1A）。在80％汇合时，通道（1：2-1：6）与乙二胺四乙酸（EDTA; 0.5毫米;培养时间4〜分钟）。
2. 胚胎体的形成（EB）
   1. 在T75烧瓶中，以高密度培养的hiPSC。
      1. ....

结果

心脏分化和EHT的制备

的hiPSC分别在低生长因子基底膜基质膨胀，用EDTA和形成在旋转烧瓶过夜胚体（EB）解离。中胚层诱导3天后，心脏分化与Wnt抑制剂的启动。后分化方案的〜17天，跳动将EB解离为单细胞的II型胶原酶（ 图1）。 EHTs从新鲜分离的心肌细胞制备每100μL的组织1.0×10 ^6个细胞的EB解离（ 图2）

讨论

工程心脏组织提供了一个有价值的选择，以心血管疾病研究的工具盒。在24井EHTs已经为疾病建模^8，14，药品安全筛选^{7，8，10，11，15，}或基本心血管研究^16，17证明是有价值的。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
EHT analysis intrument	EHT Technologies GmbH	A0001	Software is included
EHT PDMS rack	EHT Technologies GmbH	C0001
EHT PTFE spacer	EHT Technologies GmbH	C0002
EHT electrode	EHT Technologies GmbH	P0001
EHT pacing adapter/cable	EHT Technologies GmbH	P0002
24-well-plate	Nunc	144530
6 well-cell culture plate	Nunc	140675
15 ml falcon tube, graduated	Sarstedt	62,554,502
Cell scraper	Sarstedt	831,830
Spinner flask	Integra	182 101
Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct	Thermo scientific	70101	Adjust rotor speed to 40 rpm
T175 cell culture flask	Sarstedt	831,812,002
V-shaped sedimentation rack	Custom made at UKE Hamburg	na
10× DMEM	Gibco	52100
1-Thioglycerol	Sigma Aldrich	M6145
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma Aldrich	49752
Activin-A	R&D systems	338-AC
Agarose	Invitrogen	15510-019
Aprotinin	Sigma Aldrich	A1153
Aqua ad injectabilia	Baxter GmbH	1428
B27 PLUS insulin	Gibco	17504-044
BMP-4	R&D systems	314-BP
Collagenase II	Worthington	LS004176
DMEM	Biochrom	F0415
DMSO	Sigma Aldrich	D4540
DNase II, type V (from bovine spleen)	Sigma	D8764
Dorsomorphin	abcam	ab120843
EDTA	Roth	8043.2
Fetal calf serum	Gibco	10437028
FGF2	Miltenyi Biotec	130-104-921
Fibrinogen (bovine)	Sigma Aldrich	F8630
Geltrex	Gibco	A1413302	For coating: 1:200 dilution
HBSS w/o Ca2+/Mg2+	Gibco	14175-053
HEPES	Roth	9105.4
Horse serum	Life technologies	26050088
Human serum albumin	Biological Industries	05-720-1B
Insulin, human	Sigma Aldrich	I9278
L-Glutamin	Gibco	25030-024
Lipidmix	Sigma Aldrich	L5146
Matrigel	BD Biosciences	354234	For EHT reconsitutionmix.
N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide	TCI	B3082-25G
PBS w/o MgCl2/CaCl2	Biochrom	14190
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443
Polyvinyl alcohol	Sigma Aldrich	P8136
RPMI 1640	Gibco	21875
Sodium selenite	Sigma Aldrich	S5261
TGFß1	Peprotech	100-21
Thrombin	Sigma Aldrich	T7513
Transferrin	Sigma Aldrich	T8158
Y-27632	Biorbyt	orb6014
hiPSC	Custom made at UKE hamburg	na
iCell cardiomyocytes kit	Cellular Dynamics International	CMC-100-010-001
Pluricyte cardiomyocyte kit	Pluriomics	PCK-1.5
Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit	Axiogenesis AG	Ax-C-HC02-FR3
Cellartis cardiomyocytes	Takara Bio USA, Inc.	Y10075