このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

人工多能性幹細胞(hiPSC)が心筋細胞に由来からここでは、人間工学的心臓組織の生成を示しています。我々は、hERGチャネル阻害剤E-4031によって収縮力と収縮パターンの典型的な変化を分析するための方法を提示します。この方法は、心臓薬物スクリーニングのための堅牢性と適合性の高いレベルを示しています。

要約

心臓組織工学は、三次元力発生工学的組織を構成する技術が記載されています。基礎研究および前臨床医薬品開発におけるこれらの手順の実装のために、標準化された条件下での自動生成および解析のためのプロトコルを開発することが重要です。ここでは、異なる種(ラット、マウス、ヒト)の心筋細胞からエンジニア心臓組織(EHT)を生成する手法を提示します。技術は、24ウェルフォーマットで弾性ポリジメチルシロキサン(PDMS)ポスト間解離、心筋細胞を含むフィブリンゲルのアセンブリに依存しています。三次元の、力発生EHTsは、鋳造後2週間以内に構成します。この手順では、週に数百EHTsの生成を可能にし、技術的に心筋細胞の利用可能性によってのみ制限される(0.4〜1.0×10 6 / EHT)。 auxotonic筋収縮の評価はmechanで変性インキュベーションチャンバーで行われますiCalの24ウェルプレートのためのインターロックと、このチャンバの上に配置カメラ。ソフトウェアは、カメラが各EHTにXYZ軸システムに移動制御します。 EHT収縮は、自動図形認識アルゴリズムによって検出され、そして力がEHTの短縮及びPDMSポストの弾性性質および形状に基づいて算出されます。この手順は、標準化された無菌条件下でEHTの高い番号の自動分析が可能になります。心筋細胞の収縮に対する薬物効果の確実な検出は、心臓薬の開発や安全性薬理のために重要です。私たちは、それが心臓の薬の安全性スクリーニングのための有望なツールであることを示す、人間EHTシステムは、人間の心臓の収縮速度で薬物応答を複製することを、hERGチャネル阻害剤E-4031の例を、示しています。

概要

例えば、薬物誘発性QT延長症候群のような心臓の副作用は、過去数年間にわたり、市場の撤退につながっています。統計は、すべての引き出しの約45%が心血管系1上の不要な影響によるものであることを示しています。高価な発達過程および承認した後に、この薬の失敗は、製薬会社にとって最悪のシナリオです。研究開発部門は、したがって、早期に不要な心血管系への影響の検出に焦点を当てています。経済的、倫理的な問題、動物実験を削減し、新しいin vitroスクリーニングアッセイでそれらを置き換えるための努力のために進行中です。

確立されたアッセイのセットは、米国食品医薬品局(FDA)と欧州医薬品庁(EMA)催不整脈薬の効果2の前臨床評価のためのガイドラインに含まれています。の分化に続いて体細胞を再プログラミングする技術人間の人工多能性幹細胞(hiPSC)は、この研究分野3を押し上げました。現在では、 インビトロでヒト心筋細胞の新薬候補をスクリーニングする可能性を提供し、種間の違いの問題を回避できます。最近の心臓分化プロトコル4、 図5は、倫理的な懸念せずに心筋細胞の無制限の供給を提供します。しかし、収縮力の測....

プロトコル

注:次の手順は、細胞培養プロトコルを記述します。無菌条件下で実行し、予熱したメディアを使用してください。

hiPSCの1.心臓分化

  1. hiPSCを育成
    1. 成長因子低減基底膜マトリックスで被覆6ウェルプレート(1ミリリットル/ウェル)又はT75フラスコ(7ミリリットル/フラスコ)( 例えば geltrex、1:200;材料の表を参照)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中に希釈するための37°Cで30分間。基本2mMのL-グルタミンを含むDMEM / F-12培地、0.5%ペニシリン/ストレプトマイシン、5 mg / Lのトランスフェリン、5μgの/ Lセレン、0.1%ヒト血清アルブミン、1×脂質ミックス、5を混合することにより媒体FTDA 12を準備mg / Lのインスリン、50nMのドルソモルフィン、2.5 / mlのアクチビンA、0.5 / mlのヒトTGFß1及び30 / mlのFGF2。
    2. 37°C、5%CO 2、毎日培地を交換しながら、21%のO 2(AT FTDA培地と培養におけるシードhiPSC(〜3×10 5月 10日cm2で)図1A)。 (:2-1:6 1)(0.5ミリモル;インキュベーション時間〜4分EDTA)エチレンジアミン四酢酸と80....

結果

EHTの心臓分化と準備

HiPSCは、成長因子低減基底膜マトリックス上に展開EDTA、一晩スピナーフラスコに形成された胚様体(EB)を用いて解離させました。 3日間、中胚葉誘導後、心臓分化はのWnt阻害剤で開始しました。分化プロトコルの〜17日後、拍動EBをコラゲナーゼタイプII( 図1)を用いて単一細胞に分離し?.......

ディスカッション

エンジニア心臓組織は、心血管研究のツールボックスに貴重なオプションを提供しています。 24ウェルフォーマットにおけるEHTsは、疾患のモデリング8、14、薬剤の安全性スクリーニング7、8、10、11、15、または基本的な心臓血.......

開示事項

IM、TEとAHはEHT Technologies GmbH社、ドイツの共同設立者です。

謝辞

著者は、材料の彼らの現物出資のためのアレッサンドラ・モレッティとデニス・シャーデに感謝しています。私たちは、実験薬理学およびUKEの毒性の部門でのiPSとEHTワーキンググループの素晴らしいサポートを認めます。著者の作品はDZHK(循環器病研究のためのドイツ語センター)と教育のドイツの研究省(BMBF)、ドイツの研究財団(DFGエス88 / 12-1、HA 3423 / 5-1からの助成金によってサポートされています)、研究中の動物の交換洗練&リダクション(NC3Rsクラック-ITの助成金35911から259146)のために英国のナショナルセンター、英国心臓財団RM / 30157分の13、欧州研究評議会(アドバンスト・グラントIndivuHeart)、ドイツ心臓財団そしてFreieウントHansestadtハンブルク。

....

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
EHT analysis intrumentEHT Technologies GmbHA0001Software is included
EHT PDMS rackEHT Technologies GmbHC0001
EHT PTFE spacerEHT Technologies GmbHC0002
EHT electrodeEHT Technologies GmbHP0001
EHT pacing adapter/cableEHT Technologies GmbHP0002
24-well-plateNunc144530
6 well-cell culture plateNunc140675
15 ml falcon tube, graduated Sarstedt62,554,502
Cell scraperSarstedt831,830
Spinner flaskIntegra182 101
Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct Thermo scientific70101Adjust rotor speed to 40 rpm
T175 cell culture flask Sarstedt 831,812,002
V-shaped sedimentation rack Custom made at UKE Hamburgna
10× DMEMGibco52100
1-Thioglycerol Sigma AldrichM6145
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium saltSigma Aldrich49752
Activin-A R&D systems338-AC
Agarose Invitrogen15510-019
AprotininSigma AldrichA1153
Aqua ad injectabiliaBaxter GmbH1428
B27 PLUS insulin Gibco17504-044
BMP-4R&D systems314-BP
Collagenase II WorthingtonLS004176
DMEMBiochromF0415
DMSO Sigma AldrichD4540
DNase II, type V (from bovine spleen)Sigma D8764
Dorsomorphin abcamab120843
EDTA Roth8043.2
Fetal calf serumGibco10437028
FGF2Miltenyi Biotec130-104-921
Fibrinogen (bovine)Sigma AldrichF8630
Geltrex GibcoA1413302For coating: 1:200 dilution
HBSS w/o Ca2+/Mg2+ Gibco14175-053
HEPES Roth9105.4
Horse serumLife technologies26050088
Human serum albumin Biological Industries05-720-1B
Insulin, humanSigma AldrichI9278
L-GlutaminGibco25030-024
Lipidmix Sigma AldrichL5146
MatrigelBD Biosciences354234For EHT reconsitutionmix.
N-Benzyl-p-ToluenesulfonamideTCIB3082-25G
PBS w/o MgCl2/CaCl2Biochrom14190
Penicillin/StreptomycinGibco15140
Pluronic F-127 Sigma AldrichP2443
Polyvinyl alcohol Sigma AldrichP8136
RPMI 1640 Gibco21875
Sodium seleniteSigma AldrichS5261
TGFß1Peprotech100-21
ThrombinSigma AldrichT7513
Transferrin Sigma AldrichT8158
Y-27632Biorbytorb6014
hiPSCCustom made at UKE hamburgna
iCell cardiomyocytes kitCellular Dynamics InternationalCMC-100-010-001
Pluricyte cardiomyocyte kitPluriomicsPCK-1.5
Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kitAxiogenesis AGAx-C-HC02-FR3
Cellartis cardiomyocytesTakara Bio USA, Inc.Y10075

参考文献

  1. Laverty, H. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines?. Br J Pharmacol. 163 (4), 675-693 (2011).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S.

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

122

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

研究

教育

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved