Protocoles pour Visualizing stéroïdogénique organes et leurs organes interactifs avec Immunostaining dans le Fruit Fly

Nous décrivons un protocole pour la dissection, la fixation et immunomarquage des organes stéroïdogenèse chez les larves de drosophile et les femelles adultes pour étudier la biosynthèse des hormones stéroïdes et son mécanisme de régulation. En plus des organes stéroïdogenèse, nous visualisons l'innervation des organes stéroïdogenèse ainsi que les cellules cibles stéroïdogenèse telles que les cellules souches germinales.

Dans les organismes multicellulaires, un petit groupe de cellules est doté d'une fonction spécialisée dans leur activité biogénique, ce qui induit une réponse systémique à la croissance et la reproduction. Chez les insectes, la glande prothoracique des larves (PG) et les femmes jouent un rôle essentiel de l'ovaire adulte dans les hormones stéroïdes biosynthèse principales appelées ecdysteroids. Ces organes sont innervés ecdysteroidogenic du système nerveux, à travers lequel le moment de la biosynthèse est affectée par des facteurs environnementaux. Nous décrivons ici un protocole pour visualiser les organes ecdysteroidogenic et leurs organes interactifs chez les larves et les adultes de la mouche Drosophila melanogaster, qui fournit un système modèle approprié pour étudier la biosynthèse des hormones stéroïdes et son mécanisme de régulation. dissection adroite nous permet de maintenir les positions des organes ecdysteroidogenic et leurs organes interactifs, y compris le cerveau, le cordon nerveux ventral, et d'autres tissus. Immunocoloration avec unntibodies contre enzymes ecdysteroidogenic, ainsi que des protéines de fluorescence transgéniques commandés par des promoteurs spécifiques d'un tissu, sont disponibles pour marquer des cellules ecdysteroidogenic. De plus, l'innervation des organes ecdysteroidogenic peuvent également être marqués par des anticorps spécifiques ou une collection de pilotes GAL4 dans divers types de neurones. Par conséquent, les organes ecdysteroidogenic et leurs connexions neuronales peuvent être visualisées simultanément par immunocoloration et techniques transgéniques. Enfin, nous décrivons comment visualiser les cellules souches de la lignée germinale, dont la prolifération et de maintenance sont contrôlés par ecdysteroids. Cette méthode contribue à la compréhension globale de la biosynthèse des hormones stéroïdes et son mécanisme de régulation neuronale.

Dans les organismes multicellulaires, un groupe de cellules est doté d'une fonction spécialisée dans leur activité biogénique qui est essentiel pour le corps entier. Pour remplir leurs missions, chaque tissu ou organe exprime une série de gènes liés à leurs fonctions et communique avec d'autres tissus pour orchestrer leurs activités dans le cadre du développement. Pour caractériser ces fonctions cellulaires spécialisées et les interactions entre les organes, nous avons besoin de spécifier un groupe de cellules ainsi que d'autres types de cellules étant conservées intactes dans l'architecture multicellulaire.

Un exemple de ....

NOTE: Le schéma d' ensemble des protocoles est illustré à la figure 1.

1. La Dissection du larvaire Anneau Gland (RG)

NOTE: Dans D. melanogaster, qui appartient à cyclorrhaphous Diptera, le PG est dans un organe endocrine composite appelé le presse - étoupe annulaire (RG, figure 2D). Comme il est impossible que le PG est chirurgicalement séparé des autres types de cellules (vo.......

Nous avons utilisé les protocoles ci - dessus pour visualiser les organes stéroïdogenèse et leurs organes interactifs larves de D. melanogaster et les femelles adultes. Le schéma d' ensemble des protocoles est illustré à la figure 1.

Le RG, y compris le PG (Figure 2D), est plus petit et plus transparent que le cerveau et est situé au niveau du côté antérieur-dorsale du cerveau (figure 2A-C et 3A-E). Pour marquer les cellules PG, plusieurs gro.......

Nous avons étudié la biosynthèse ecdystéroïde et son mécanisme de réglementation D. melanogaster, et a élaboré un protocole de dissection et immunomarquage. Le moment de la biosynthèse ecdystéroïde est affectée par des facteurs environnementaux à travers les entrées de neurones ^33, il est donc essentiel de maintenir l'innervation des organes ecdysteroidogenic ainsi que le cerveau, VNC, et d' autres tissus lors de la dissection.

Comme d?.......

Nous remercions Reiko Kise et Tomotsune Ameku pour leur soutien technique pour ce travail. Nous sommes également reconnaissants envers Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko koto, Masayuki Miura, le Stock Center drosophile Bloomington, KYOTO Stock Center (DGRC), et les études de développement Hybridome Banque pour les stocks et réactifs. Ce travail a été soutenu par des subventions à YSN de JSPS KAKENHI Grant Numéro 16K20945, La Fondation Naito et Inoue Prix scientifique de la recherche; et par une subvention à RN de MEXT KAKENHI Grant Numéro 16H04792.