Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Developmental Biology
אנו מתארים פרוטוקול לנתיחה, קיבעון, ו immunostaining של איברי steroidogenic אצל נשי זחלים בוגרים דרוזופילה ללמוד ביוסינתזה הורמון סטרואידים ואת מנגנון הרגולציה שלה. בנוסף לאיברים steroidogenic, אנו לדמיין את העצבוב של איברים steroidogenic כמו גם תאי היעד steroidogenic כגון תאי גזע germline.
בשנת יצורים רב-תאיים, קבוצה קטנה של תאים הוא ניחן פונקציה מיוחדת בפעילות שלהם ביוגני, גרימת תגובה מערכתית כדי גידול ורבייה. בשנת חרקים, בלוטת prothoracic הזחל (PG) ואת התפקידים החיוניים השחלה משחק הנקבה הבוגרת ב biosynthesizing ההורמונים הסטרואידים העיקרי שנקרא ecdysteroids. אברי ecdysteroidogenic אלה מעוצבבים ממערכת העצבים, שדרכו עיתוי ביוסינתזה מושפעת לגירויים סביבתיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול המאפשר הדמית איברי ecdysteroidogenic והאיברים האינטרקטיוויים שלהם זחלים ומבוגרים של זבוב הפרות תסיסנית, אשר מספקת מערכת מודל מתאימה ללימוד ביוסינתזה הורמון סטרואידים ואת מנגנון הרגולציה שלה. דיסקציה מיומנת מאפשרת לנו לשמור על העמדות של איברי ecdysteroidogenic והאיברים האינטרקטיוויים שלהם כולל המוח, חוט עצב הגחון, ורקמות אחרות. Immunostaining עםntibodies נגד אנזימי ecdysteroidogenic, יחד עם חלבוני קרינה מהונדסים מונעים על ידי יזמי רקמות ספציפיות, זמינה לתייג תאי ecdysteroidogenic. יתר על כן, innervations של איברי ecdysteroidogenic יכול גם להיות מתויג על ידי נוגדנים ספציפיים או אוסף של נהגי GAL4 בסוגים שונים של נוירונים. לכן, איברי ecdysteroidogenic והקשרים העצביים שלהם ניתן דמיינו בו זמנית על ידי immunostaining וטכניקות מהונדסות. לבסוף, אנו מתארים כיצד לחזות תאי גזע germline, אשר התפשטות ותחזוקה נשלטים על ידי ecdysteroids. שיטה זו תורמת להבנה מקיפה של ביוסינתזה הורמון סטרואידים ואת מנגנון הרגולטורים העצבי שלו.
בשנת יצורים רב-תאיים, קבוצת תאים הוא ניחן פונקציה מיוחדת בפעילות שלהם ביוגני כי הוא חיוני לגוף כולו. כדי למלא את משימותיהם, בכל רקמה או איבר מבטא שורה של גנים הקשורים לתפקידם ומתקשרת עם רקמות אחרות לתזמר את פעילותם בהקשר של פיתוח. כדי לאפיין פונקציות הסלולר מיוחדות כגון ואינטראקציות בין-איבר, אנו צריכים לציין קבוצת התאים יחד עם סוגים אחרים של תאי אצלינו שלמים בארכיטקטורה הרבה-התאית.
דוגמא אחת של איברים מיוחדים כגון היא איבר steroidogenic, שבו אנזימי biosynthetic רבים לתווך שלבי ההמרה מכולסטרול להורמוני סטרואידים פעילים 1. רוב גני אנזימי....
השתמשנו בפרוטוקולים לעיל כדי להמחיש איברי steroidogenic ואיברים האינטרקטיוויים שלהם אצל נשי זחלי melanogaster ד ו בוגרת. בראייה הכוללת של פרוטוקולים מוצגת באיור 1.
RG, כולל PG (איור 2 ד), הוא קטן יותר ושקוף יותר במוח והוא ממוקם בצד-הגבה הקדמי של ה.......
למדנו ביוסינתזה ecdysteroid מנגנון הרגולציה שלה ב ד melanogaster, ועבדתי פרוטוקול לנתיחת immunostaining. התזמון של ביוסינתזה ecdysteroid מושפע לגירויים סביבתיים באמצעות תשומות עצביות 33, כך שחיוני לשמר את העצבוב של איברי ecdysteroidogenic יחד עם המוח, VNC, ורקמות אחרות במהלך לנתיחה. .......
אנו מודים רייקו כסא ו Tomotsune Ameku לתמיכה הטכנית שלהם עבור עבודה זו. אנחנו גם מודה Kei איטו, אולגה Alekseyenko, אקיקו קוטו, מסאיוקי מיורה, מרכז במלאי Bloomington תסיסנית, קיוטו לניירות מרכז (DGRC), והבנק התפתחותית מחקרים Hybridoma עבור מניות ריאגנטים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים YSN מן JSPs KAKENHI גרנט מספר 16K20945, קרן נאיטו, ו Inoue מדע ומחקר פרס; ועל ידי מענק RN מ MEXT KAKENHI גרנט מספר 16H04792.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
egg collection | |||
tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
rearing larvae | |||
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
standard fly food | the recepi us on the website of Blooington stock center. | ||
dissection | |||
dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
Terumo syringe, 1ml | TERUMO | SS-01T | |
forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
fixation | |||
ultrapure water | Merck Millipore | ||
phosphate buffered saline (PBS) | |||
Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
Incubation | |||
As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
primary antibody | |||
anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
secondary antibody | |||
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
Mounting reagents | |||
Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
imaging | |||
LSM700 laser scanning microscope system | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP left | |
image processing | |||
LSM700 ZEN | Carl Zeiss | It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system | |
ImageJ | |||
Fly stocks | |||
w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
w[1118] | |||
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved