Protocolli per la visualizzazione steroidogenica organi e dei loro organi interattivi con Immunocolorazione nella mosca della frutta

Descriviamo un protocollo per la dissezione, la fissazione, e immunocolorazione di organi steroidogeniche in Drosophila larve e adulti femmine per studiare steroidi biosintesi dell'ormone e del suo meccanismo di regolazione. Oltre agli organi steroidogenici, visualizziamo l'innervazione degli organi steroidogeniche così come cellule bersaglio steroidogeniche come le cellule staminali germinali.

Negli organismi multicellulari, un piccolo gruppo di cellule è dotato di una funzione specializzata nella loro attività biogenica, inducendo una risposta sistemica crescita e la riproduzione. Negli insetti, ghiandola larvale prothoracic (PG) e le femmine adulte azione ovaio ruoli essenziali biosynthesizing principali ormoni steroidei chiamati ecdysteroids. Questi organi ecdysteroidogenic sono innervati dal sistema nervoso, attraverso cui la temporizzazione della biosintesi è influenzato da stimoli ambientali. Qui si descrive un protocollo per la visualizzazione degli organi e dei loro organi ecdysteroidogenic interattivi in larve e adulti della mosca della frutta Drosophila melanogaster, che fornisce un sistema modello adatto per lo studio ormone steroide biosintesi e il suo meccanismo di regolazione. dissezione abile permette di mantenere le posizioni degli organi ecdysteroidogenic e dei loro organi interattivi compreso il cervello, il cordone nervoso ventrale, e altri tessuti. Immunocolorazione con unntibodies contro enzimi ecdysteroidogenic, insieme a proteine ​​transgeniche fluorescenza guidati dai promotori tessuto-specifici, sono disponibili per marcare le cellule ecdysteroidogenic. Inoltre, i innervazione degli organi ecdysteroidogenic possono anche essere etichettati da anticorpi specifici o una serie di driver GAL4 in vari tipi di neuroni. Pertanto, gli organi ecdysteroidogenic e le loro connessioni neuronali possono essere visualizzati simultaneamente mediante immunocolorazione e tecniche transgeniche. Infine, si descrive come visualizzare le cellule staminali germinali, la cui proliferazione e manutenzione sono controllate da ecdysteroids. Questo metodo contribuisce alla comprensione globale di steroide biosintesi dell'ormone e del suo meccanismo di regolazione neuronale.

Negli organismi multicellulari, un gruppo di celle è dotato di una funzione specializzata nella loro attività biogenica che è essenziale per tutto il corpo. Assolvere i loro compiti, ogni tessuto o organo esprime una serie di geni correlati alle loro funzioni e comunica con altri tessuti orchestrare loro attività nel contesto dello sviluppo. Caratterizzare tali funzioni cellulari specializzate e interazioni tra organi, è necessario specificare un gruppo di celle insieme ad altri tipi di celle essendo mantenuta intatta nell'architettura multicellulare.

Un esempio di tali organi specializzati è un organo steroidea, dove molti enzimi bio....

NOTA: Lo schema generale dei protocolli è mostrato in Figura 1.

1. La dissezione del larvale Anello Gland (RG)

NOTA: In D. melanogaster, che appartiene alla Ditteri cyclorrhaphous, il PG è all'interno di un organo endocrino composito chiamato ghiandola anello (RG, Figura 2D). Poiché è irrealizzabile che il PG è chirurgicamente separato da altri tipi di cellule (discussi in seguit.......

Abbiamo usato i protocolli di cui sopra per visualizzare gli organi steroidogenici e dei loro organi interattivi in D. melanogaster larve e adulti di sesso femminile. Lo schema generale di protocolli è mostrato in Figura 1.

RG, compreso il PG (Figura 2D), è più piccolo e più trasparente del cervello e si trova sul lato antero-dorsale del cervello (Figura 2A-C e 3A-E). Per marcare le cellule PG, molti gruppi hanno generato vari tipi di anticorpi contro e.......

Abbiamo studiato biosintesi ecdysteroid e il suo meccanismo di regolazione in D. melanogaster, ed ideato un protocollo per la dissezione e immunocolorazione. I tempi di biosintesi ecdysteroid è influenzato da stimoli ambientali attraverso ingressi neuronali ^33, quindi è essenziale per mantenere l'innervazione degli organi ecdysteroidogenic insieme al cervello, VNC, e altri tessuti durante la dissezione.

Come descritto sopra, il D. melanogaster .......

Ringraziamo Reiko Kise e Tomotsune Ameku per il loro supporto tecnico per questo lavoro. Siamo anche grati a Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, il Bloomington Drosophila Stock Center, Kyoto Stock Center (DGRC), e il Developmental Studies Ibridoma Banca per le scorte e reagenti. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a YSN da JSPS KAKENHI Concessione Numero 16K20945, la Fondazione Naito, e il Premio Ricerca Scienza Inoue; e da una sovvenzione alla RN da MEXT KAKENHI Concessione Numero 16H04792.