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Developmental Biology

과일 플라이의 면역 염색과 Steroidogenic 기관 및 그들의 상호 작용하는 장기를 시각화하기위한 프로토콜

Published: April 14th, 2017

DOI:

10.3791/55519

1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Life Science Center of Tsukuba Advanced Research Alliance, University of Tsukuba, 3Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba
* These authors contributed equally

우리는 해부, 고정, 스테로이드 호르몬 생합성과 규제 메커니즘을 연구하는 초파리 유충과 성인 여성의 steroidogenic 장기의 면역 염색을위한 프로토콜을 설명합니다. steroidogenic 기관뿐만 아니라, 우리는 배아 줄기 세포로 steroidogenic 기관의 신경 분포뿐만 아니라 steroidogenic 표적 세포를 시각화.

다세포 생물에있어서, 세포의 작은 그룹은 성장과 재생에 대한 조직 반응을 유도하는 그들의 생물학적 활성의 특수한 기능을 부여한다. 곤충, 애벌레 prothoracic 글 랜드 (PG) 및 ecdysteroids라는 주요 스테로이드 호르몬 생합성에있는 성인 여성의 난소 플레이 필수적인 역할. 이러한 기관은 ecdysteroidogenic 생합성 타이밍 큐 환경에 의해 영향을 받는다되는 신경계에서 신경 지배된다. 여기에서 우리는 스테로이드 호르몬 생합성과 규제 메커니즘을 연구하기위한 적절한 모델 시스템을 제공 초파리 melanogaster의를 비행 ecdysteroidogenic 기관과 유충에서의 대화 형 기관과 과일의 성인을 시각화하는 프로토콜을 설명합니다. 숙련 된 해부은 우리가 뇌, 복부 신경 코드 및 다른 조직을 포함하여 ecdysteroidogenic 기관의 위치와 그들의 상호 작용하는 기관을 유지할 수 있습니다. 로모그래퍼 면역 염색ecdysteroidogenic 효소에 대한 ntibodies는 조직 - 특이 적 프로모터에 의해 구동 형질 전환 형광 단백질과 함께 ecdysteroidogenic 세포를 레이블을 사용할 수 있습니다. 또한, ecdysteroidogenic 기관의 신경 밀도는 특정 항체 또는 신경의 여러 유형에 GAL4 드라이버의 집합으로 분류 될 수있다. 따라서 ecdysteroidogenic 기관과 신경 세포의 연결은 면역 염색 및 형질 전환 기술에 의해 동시에 시각화 할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 누구의 증식과 유지 보수 ecdysteroids에 의해 제어되는 배아 줄기 세포를 시각화하는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 스테로이드 호르몬 생합성과 신경 규제 메커니즘의 포괄적 인 이해에 기여한다.

다세포 생물에서는 세포의 그룹은 몸 전체에 필수적인 그들의 생체 활동의 전문 기능을 부여한다. 자신의 임무를 완수하기 위해 각 조직이나 기관의 기능과 관련된 유전자의 일련의 표현과 발전의 맥락에서 자신의 활동을 조율하기 위해 다른 조직과 통신한다. 이러한 전문적인 세포 기능과 간 장기 상호 작용을 특성화하기 위해, 우리는 다른 종류의 세포가 다세포 구조에서 그대로 유지되고 함께 세포의 그룹을 지정해야합니다.

이러한 전문 기관의 한 예는 많은 생합성 효소가 활성화 스테로이드 호르몬 1 콜레스테롤에서 변환 단계를 중재 steroidogenic 기관이다. 이러한 효소 유전자의 대부분은 기관 steroidogenic 구체적으로 표현되고, 생합성 경로 단단히 체액 입력 및 신경 입력을 통해 다수의 외부 자극에 의해 조절된다. 일단합성 스테로이드 호르몬은 체액으로 분비되는 유전자 (2)의 다양한 종류의 발현을 조절하기위한 여러 조직 및 기관을 대상으로한다. 따라서, 스테로이드 호르몬의 작용은 항상성, 성장 및 재생을 유지하기 위해 전신 반응을 유도한다.

스테로이드 호르몬 생합성 기능 및 스테로이드 호르몬의다면 발현....

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참고 : 프로토콜의 전체 구조는 그림 1과 같다.

1. 애벌레 링 선의 해부 (RG)

참고 : D에서. cyclorrhaphous 파리목에 속하는 melanogaster의는 상기 PG는 복합 내분비 장기 링 마개 (RG,도 2D)라는 조건. PG는 수술 (후술하는) 다른 유형의 세포로부터 분리하는 것이 실행할 수 없게되기 때문에, 실제 타겟 절개하?.......

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우리는 steroidogenic 기관 및 D. melanogaster의 유충과 성인 여성에서의 대화 형 장기를 시각화하기 위해 위의 프로토콜을 사용했다. 프로토콜의 전체 구조는 그림 1과 같다.

PG (도 2D), 뇌보다 더 작고 더 투명하고, 뇌 (도 2A 및 3A-C-E)의 전방 - 등쪽 측에 위치하고 포함 RG. PG 셀 라벨을 여러 그룹 ecdysteroidogenic 효소에 대한 항체의 다양한 형태를 ?.......

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우리는 ecdysteroid 생합성 및 D. melanogaster의에서의 규제 메커니즘을 연구하고, 해부 및 면역 염색을위한 프로토콜을 고안했다. ecdysteroid 생합성의 타이밍은 신경 입력 큐 (33)의 환경에 의해 영향을받는, 그래서 박리시 뇌 VNC 및 다른 조직과 함께 ecdysteroidogenic 기관의 신경 분포를 유지하기 위해 필수적이다.

전술 한 바와 같이, D. melanogaster의.......

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우리는이 작품에 대한 자신의 기술 지원 레이코 키세 및 Tomotsune Ameku 감사합니다. 우리는 또한 케이 이토, 올가 알렉시앙코, 아키코 고토 마사유키 미우라, 블루밍턴 초파리 증권 센터, 교토 증권 센터 (DGRC)과 주식 및 시약의 발달 연구 하이 브리 도마 은행에 감사하고 있습니다. 이 작품은 JSPS KAKENHI 허가 번호 16K20945, 나이토 재단, 그리고 이노우에 과학 연구 상에서 YSN 보조금에 의해 지원되었다; 및 문부 과학성 KAKENHI 허가 번호 16H04792에서 RN에 그랜트.

....

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NameCompanyCatalog NumberComments
egg collection
tissue culture dish (55 mm)AS ONE1-8549-02 for grape-juice agar plates
collection cupHIKARI KAGAKU
yeast pasteOriental dry yeast, Tokyo
100% grape juiceWelch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS)SARSTEDT58.487
disposable loopAS ONE6-488-01
standard fly food the recepi us on the website of Blooington stock center.
dissection
dissecting microscopeCarl ZeissStemi 2000-C
dissecting microscopeLeicaS8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated)IWAKI1000-035
SylgardTORAYcoarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) TERUMONN-2719SA "knife" to cut the tissue
Terumo syringe,　1mlTERUMOSS-01T
forceps, Inox, #5Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter)Shiga Brandfor fillet dissection
micro scissorsNATSUME SEISAKUSHO CO LTD. MB-50-10
fixation
ultrapure waterMerck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
FormaldehydeNacalai tesque16222-65
ParaformaldehydeNacalai tesque02890-45
Triton-X100Nacalai tesque35501-15
microtubes (1.5 ml)INA OPTIKACF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker)As oneTM-300rocker
Bovine Serum AlbuminSIGMA9048-46-8
primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000Molecular ProbesA6455Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100Nakarai tesque04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500SIGMAS5545
anti-Hts 1B1 (mouse)Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20DSHBDCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50DSHBnc82
secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugateLife TechnologiesA-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugateLife TechnologiesA-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugateLife TechnologiesA-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateLife TechnologiesA-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidinLife TechnologiesA-22283
Mounting reagents
Micro slide glassMatsunami Glass Ind.,Ltd.SS7213
Square microscope cover glassMatsunami Glass Ind.,Ltd.C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent)Calbiochem345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper)WATSON5660-222-1S
imaging
LSM700 laser scanning microscope systemCarl Zeissinverted Axio Observer. Z1 SP left
image processing
LSM700 ZENCarl ZeissIt is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system
ImageJ
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4 from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFPgifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)
w; UAS-mCD8::GFP from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4 from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)

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