Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Developmental Biology
Se describe un protocolo para la disección, la fijación y la inmunotinción de órganos androgénica en Drosophila larvas y adultos hembras para estudiar la biosíntesis de hormonas esteroideas y su mecanismo de regulación. Además de los órganos androgénica, visualizamos la inervación de los órganos androgénica, así como células diana androgénica, tales como las células madre de línea germinal.
En los organismos multicelulares, un pequeño grupo de células está dotado de una función especializada en su actividad biogénica, la inducción de una respuesta sistémica a crecimiento y reproducción. En los insectos, la glándula larval prothoracic (PG) y las hembras adultas de juego ovario papeles esenciales en la biosíntesis de los principales hormonas esteroides llamados ecdysteroids. Estos órganos ecdysteroidogenic están inervados desde el sistema nervioso, a través del cual la temporización de la biosíntesis se ve afectada por las señales ambientales. Aquí se describe un protocolo para la visualización de órganos ecdysteroidogenic y sus órganos interactivos en larvas y adultos de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, que proporciona un sistema modelo adecuado para el estudio de la biosíntesis de hormonas esteroideas y su mecanismo de regulación. disección hábil nos permite mantener las posiciones de los órganos ecdysteroidogenic y sus órganos interactivos, incluyendo el cerebro, el cordón nervioso ventral, y otros tejidos. La inmunotinción con unantibodies contra enzimas ecdysteroidogenic, junto con las proteínas de fluorescencia transgénicos conducidos por promotores específicos de tejido, están disponibles para marcar las células ecdysteroidogenic. Por otra parte, la inervación de los órganos ecdysteroidogenic también pueden marcarse por anticuerpos específicos o una colección de controladores de GAL4 en diversos tipos de neuronas. Por lo tanto, los órganos ecdysteroidogenic y sus conexiones neuronales pueden ser visualizadas simultáneamente por inmunotinción y técnicas transgénicas. Por último, se describe cómo visualizar las células madre de línea germinal, cuya proliferación y mantenimiento son controlados por ecdysteroids. Este método contribuye a la comprensión global de la biosíntesis de la hormona esteroide y su mecanismo de regulación neuronal.
En los organismos multicelulares, un grupo de células está dotado de una función especializada en su actividad biogénica que es esencial para todo el cuerpo. Para cumplir su cometido, cada tejido u órgano expresa una serie de genes relacionados con sus funciones y se comunica con otros tejidos para orquestar sus actividades en el contexto del desarrollo. Para caracterizar este tipo de funciones celulares especializadas y las interacciones entre órganos, tenemos que especificar un grupo de células junto con otros tipos de células que se mantienen intactos en la arquitectura multicelular.
Un ejemplo de tales órganos especializados es un órg....
NOTA: El esquema general de protocolos se muestra en la Figura 1.
1. La disección de la larval anillo prensaestopas (RG)
NOTA: En D. melanogaster, que pertenece a Diptera cyclorrhaphous, el PG está dentro de un órgano endocrino compuesto llama la glándula anillo (RG, la Figura 2D). Puesto que es inviable que el PG se separa quirúrgicamente de otros tipos de células (discutidos más .......
Se utilizaron los protocolos anteriores para visualizar los órganos androgénica y sus órganos interactivos en D. melanogaster larvas y adultos hembras. El esquema general de protocolos se muestra en la Figura 1.
El RG, incluyendo el PG (Figura 2D), es más pequeño y más transparente que el cerebro y se encuentra en el lado anterior-dorsal del cerebro (Figura 2A-C y 3A-E). Para etiquetar las células PG, varios grupos han generado varios tipos de anticu.......
Se estudió la biosíntesis ecdisteroide y su mecanismo de regulación en D. melanogaster, e ideó un protocolo para la disección y la inmunotinción. El momento de la biosíntesis de ecdiesteroide se ve afectada por las señales ambientales a través de entradas neuronales 33, por lo que es esencial para mantener la inervación de los órganos ecdysteroidogenic junto con el cerebro, VNC, y otros tejidos durante la disección.
Como se describió anteriorment.......
Agradecemos a Reiko Kise y Tomotsune Ameku por su apoyo técnico a este trabajo. Agradecemos también a Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, el Bloomington Drosophila Stock Center, Kyoto Stock Center (DGRC), y el Banco hibridoma Estudios del Desarrollo de las acciones y los reactivos. Este trabajo fue apoyado por becas a YSN de JSP KAKENHI la subvención Número 16K20945, La Fundación Naito, y el Premio de Investigación de Ciencias Inoue; y con una donación a RN de MEXT KAKENHI la subvención Número 16H04792.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
egg collection | |||
tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
rearing larvae | |||
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
standard fly food | the recepi us on the website of Blooington stock center. | ||
dissection | |||
dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
Terumo syringe, 1ml | TERUMO | SS-01T | |
forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
fixation | |||
ultrapure water | Merck Millipore | ||
phosphate buffered saline (PBS) | |||
Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
Incubation | |||
As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
primary antibody | |||
anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
secondary antibody | |||
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
Mounting reagents | |||
Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
imaging | |||
LSM700 laser scanning microscope system | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP left | |
image processing | |||
LSM700 ZEN | Carl Zeiss | It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system | |
ImageJ | |||
Fly stocks | |||
w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
w[1118] | |||
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
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