Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Developmental Biology
Vi beskriver ett protokoll för dissektion, fixering och immunfärgning av steroidogena organ i Drosophila larver och vuxna kvinnor att studera steroid biosyntes hormon och dess regleringsmekanism. Förutom steroidogena organ, visualisera vi innervation av steroidogena organ samt steroidogena målceller såsom groddlinje stamceller.
I flercelliga organismer, är en liten grupp av celler utrustad med en specialiserad funktion i sin biogena aktiviteten inducerar en systemisk reaktion på tillväxt och reproduktion. I insekter, larver prothoracic körteln (PG) och den vuxna kvinnliga äggstocken spela viktiga roller i biosyntes de viktigaste steroidhormoner som kallas ecdysteroids. Dessa ecdysteroidogenic organ innerveras från nervsystemet, genom vilka tidpunkten för biosyntes påverkas av miljöfaktorer. Här beskriver vi ett protokoll för att visualisera ecdysteroidogenic organ och deras interaktiva organ i larver och vuxna i bananflugan Drosophila melanogaster, vilket ger en lämplig modellsystem för att studera steroidhormoner biosyntesen och dess regleringsmekanism. Skicklig dissektion ger oss möjlighet att behålla positionerna för ecdysteroidogenic organ och deras interaktiva organ, inklusive hjärnan, den ventrala nerv sladd, och andra vävnader. Immunfärgning med enntibodies mot ecdysteroidogenic enzymer, tillsammans med transgena fluorescensproteiner drivna av vävnadsspecifika promotorer, är tillgängliga för att märka ecdysteroidogenic celler. Dessutom kan de innervationer av ecdysteroidogenic organ också märkas genom specifika antikroppar eller en samling av GAL4 förare i olika typer av neuroner. Därför kan ecdysteroidogenic organ och deras neuronala anslutningar visualiseras samtidigt av immunfärgning och transgena tekniker. Slutligen beskriver vi hur man visualisera könsceller stamceller, vars spridning och underhåll styrs av ecdysteroids. Denna metod bidrar till övergripande förståelse av steroid biosyntes hormon och dess neuronal regleringsmekanism.
I flercelliga organismer, är en grupp av celler utrustad med en specialiserad funktion i sin biogena aktivitet som är viktigt för hela kroppen. Att fullgöra sina uppgifter, varje vävnad eller organ uttrycker en rad gener relaterade till deras funktioner och kommunicerar med andra vävnader att iscensätta sin verksamhet i samband med utveckling. För att karakterisera sådana specialiserade cellulära funktioner och interaktioner mellan organ behöver vi ange en grupp celler tillsammans med andra typer av celler hålls intakt i flercelliga arkitekturen.
Ett exempel på sådana specialiserade organ är en steroidogen organ, där många biosyntetiska e....
OBS: Den övergripande systemet för protokoll visas i figur 1.
1. Dissekering av Larvernas ring Gland (RG)
OBS: I D. melanogaster, som hör till cyclorrhaphous Diptera, är PG inuti en komposit endokrint organ som kallas ringen körteln (RG, figur 2D). Eftersom det är omöjligt att PG är kirurgiskt separerad från andra typer av celler (som diskuteras senare), är en praktisk mål att .......
Vi använde ovanstående protokoll för att visualisera steroidogena organ och deras interaktiva organ i D. melanogaster larver och vuxna kvinnor. Det övergripande systemet för protokoll visas i figur 1.
RG, inklusive PG (figur 2D), är mindre och mer transparent än hjärnan och är belägen vid den främre-dorsala sidan av hjärnan (figur 2A-C och 3A-E). Att märka PG celler har flera grupper genererat olika typer av antikroppar mot ecdysteroidogenic en.......
Vi studerade ecdysteroid biosyntesen och dess regleringsmekanism i D. melanogaster, och utarbetat ett protokoll för dissekering och immunfärgning. Tidpunkten för ecdysteroid biosyntes påverkas av miljöfaktorer genom neuronala ingångar 33, så det är viktigt att bibehålla innervation av de ecdysteroidogenic organ tillsammans med hjärnan, VNC, och andra vävnader under dissekering.
Såsom beskrivits ovan, D. melanogaster PG bildar ett komplex .......
Vi tackar Reiko Kise och Tomotsune Ameku för deras tekniska stöd för detta arbete. Vi är också tacksamma mot Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, Bloomington Drosophila Lager Center, KYOTO Stock Center (DGRC) och utvecklingsstudier Hybridoma Bank för aktier och reagens. Detta arbete har finansierats med bidrag till YSN från JSPS KAKENHI Grant Number 16K20945, The Naito Foundation och Inoue Science Research Award; och genom ett bidrag till RN från MEXT KAKENHI Grant Number 16H04792.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
egg collection | |||
tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
rearing larvae | |||
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
standard fly food | the recepi us on the website of Blooington stock center. | ||
dissection | |||
dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
Terumo syringe, 1ml | TERUMO | SS-01T | |
forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
fixation | |||
ultrapure water | Merck Millipore | ||
phosphate buffered saline (PBS) | |||
Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
Incubation | |||
As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
primary antibody | |||
anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
secondary antibody | |||
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
Mounting reagents | |||
Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
imaging | |||
LSM700 laser scanning microscope system | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP left | |
image processing | |||
LSM700 ZEN | Carl Zeiss | It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system | |
ImageJ | |||
Fly stocks | |||
w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
w[1118] | |||
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved