JoVE Logo
Faculty Resource Center

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Developmental Biology

Protokoll för Visualisering steroidogena organ och deras interaktiva organ med immunfärgning i fruktflugan

Published: April 14th, 2017

DOI:

10.3791/55519

1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Life Science Center of Tsukuba Advanced Research Alliance, University of Tsukuba, 3Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba
* These authors contributed equally

Vi beskriver ett protokoll för dissektion, fixering och immunfärgning av steroidogena organ i Drosophila larver och vuxna kvinnor att studera steroid biosyntes hormon och dess regleringsmekanism. Förutom steroidogena organ, visualisera vi innervation av steroidogena organ samt steroidogena målceller såsom groddlinje stamceller.

I flercelliga organismer, är en liten grupp av celler utrustad med en specialiserad funktion i sin biogena aktiviteten inducerar en systemisk reaktion på tillväxt och reproduktion. I insekter, larver prothoracic körteln (PG) och den vuxna kvinnliga äggstocken spela viktiga roller i biosyntes de viktigaste steroidhormoner som kallas ecdysteroids. Dessa ecdysteroidogenic organ innerveras från nervsystemet, genom vilka tidpunkten för biosyntes påverkas av miljöfaktorer. Här beskriver vi ett protokoll för att visualisera ecdysteroidogenic organ och deras interaktiva organ i larver och vuxna i bananflugan Drosophila melanogaster, vilket ger en lämplig modellsystem för att studera steroidhormoner biosyntesen och dess regleringsmekanism. Skicklig dissektion ger oss möjlighet att behålla positionerna för ecdysteroidogenic organ och deras interaktiva organ, inklusive hjärnan, den ventrala nerv sladd, och andra vävnader. Immunfärgning med enntibodies mot ecdysteroidogenic enzymer, tillsammans med transgena fluorescensproteiner drivna av vävnadsspecifika promotorer, är tillgängliga för att märka ecdysteroidogenic celler. Dessutom kan de innervationer av ecdysteroidogenic organ också märkas genom specifika antikroppar eller en samling av GAL4 förare i olika typer av neuroner. Därför kan ecdysteroidogenic organ och deras neuronala anslutningar visualiseras samtidigt av immunfärgning och transgena tekniker. Slutligen beskriver vi hur man visualisera könsceller stamceller, vars spridning och underhåll styrs av ecdysteroids. Denna metod bidrar till övergripande förståelse av steroid biosyntes hormon och dess neuronal regleringsmekanism.

I flercelliga organismer, är en grupp av celler utrustad med en specialiserad funktion i sin biogena aktivitet som är viktigt för hela kroppen. Att fullgöra sina uppgifter, varje vävnad eller organ uttrycker en rad gener relaterade till deras funktioner och kommunicerar med andra vävnader att iscensätta sin verksamhet i samband med utveckling. För att karakterisera sådana specialiserade cellulära funktioner och interaktioner mellan organ behöver vi ange en grupp celler tillsammans med andra typer av celler hålls intakt i flercelliga arkitekturen.

Ett exempel på sådana specialiserade organ är en steroidogen organ, där många biosyntetiska e....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

OBS: Den övergripande systemet för protokoll visas i figur 1.

1. Dissekering av Larvernas ring Gland (RG)

OBS: I D. melanogaster, som hör till cyclorrhaphous Diptera, är PG inuti en komposit endokrint organ som kallas ringen körteln (RG, figur 2D). Eftersom det är omöjligt att PG är kirurgiskt separerad från andra typer av celler (som diskuteras senare), är en praktisk mål att .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi använde ovanstående protokoll för att visualisera steroidogena organ och deras interaktiva organ i D. melanogaster larver och vuxna kvinnor. Det övergripande systemet för protokoll visas i figur 1.

RG, inklusive PG (figur 2D), är mindre och mer transparent än hjärnan och är belägen vid den främre-dorsala sidan av hjärnan (figur 2A-C och 3A-E). Att märka PG celler har flera grupper genererat olika typer av antikroppar mot ecdysteroidogenic en.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi studerade ecdysteroid biosyntesen och dess regleringsmekanism i D. melanogaster, och utarbetat ett protokoll för dissekering och immunfärgning. Tidpunkten för ecdysteroid biosyntes påverkas av miljöfaktorer genom neuronala ingångar 33, så det är viktigt att bibehålla innervation av de ecdysteroidogenic organ tillsammans med hjärnan, VNC, och andra vävnader under dissekering.

Såsom beskrivits ovan, D. melanogaster PG bildar ett komplex .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi tackar Reiko Kise och Tomotsune Ameku för deras tekniska stöd för detta arbete. Vi är också tacksamma mot Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, Bloomington Drosophila Lager Center, KYOTO Stock Center (DGRC) och utvecklingsstudier Hybridoma Bank för aktier och reagens. Detta arbete har finansierats med bidrag till YSN från JSPS KAKENHI Grant Number 16K20945, The Naito Foundation och Inoue Science Research Award; och genom ett bidrag till RN från MEXT KAKENHI Grant Number 16H04792.

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
egg collection
tissue culture dish (55 mm)AS ONE1-8549-02 for grape-juice agar plates
collection cupHIKARI KAGAKU
yeast pasteOriental dry yeast, Tokyo
100% grape juiceWelch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS)SARSTEDT58.487
disposable loopAS ONE6-488-01
standard fly food the recepi us on the website of Blooington stock center.
dissection
dissecting microscopeCarl ZeissStemi 2000-C
dissecting microscopeLeicaS8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated)IWAKI1000-035
SylgardTORAYcoarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) TERUMONN-2719SA "knife" to cut the tissue
Terumo syringe, 1mlTERUMOSS-01T
forceps, Inox, #5Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter)Shiga Brandfor fillet dissection
micro scissorsNATSUME SEISAKUSHO CO LTD. MB-50-10
fixation
ultrapure waterMerck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
FormaldehydeNacalai tesque16222-65
ParaformaldehydeNacalai tesque02890-45
Triton-X100Nacalai tesque35501-15
microtubes (1.5 ml)INA OPTIKACF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker)As oneTM-300rocker
Bovine Serum AlbuminSIGMA9048-46-8
primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000Molecular ProbesA6455Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100Nakarai tesque04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500SIGMAS5545
anti-Hts 1B1 (mouse)Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20DSHBDCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50DSHBnc82
secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugateLife TechnologiesA-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugateLife TechnologiesA-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugateLife TechnologiesA-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateLife TechnologiesA-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidinLife TechnologiesA-22283
Mounting reagents
Micro slide glassMatsunami Glass Ind.,Ltd.SS7213
Square microscope cover glassMatsunami Glass Ind.,Ltd.C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent)Calbiochem345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper)WATSON5660-222-1S
imaging
LSM700 laser scanning microscope systemCarl Zeissinverted Axio Observer. Z1 SP left
image processing
LSM700 ZENCarl ZeissIt is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system
ImageJ
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4 from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFPgifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)
w; UAS-mCD8::GFP from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4 from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)

  1. Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
  2. Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
  3. Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
  4. Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
  5. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
  6. Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
  7. Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
  8. Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
  9. Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
  10. Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).
  11. Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32 (2015).
  12. Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123 (2016).
  13. Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
  14. Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O'Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
  15. Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O'Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
  16. Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
  17. Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
  18. Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
  19. McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
  20. Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778 (2014).
  21. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
  22. Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
  23. Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
  24. Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
  25. Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
  26. Parvy, J. -. P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
  27. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  28. Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
  29. Li, H. -. H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
  30. Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806 (2010).
  31. Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
  32. Song, X., Zhu, C. -. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
  33. Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
  34. Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
  35. Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
  36. Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712 (2015).
  37. Yamanaka, N., Marqués, G., O'Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
  38. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
  39. Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211 (2015).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved