JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Developmental Biology

Sineği boyanmasına ile steroidogenik organları ve İnteraktif Organlar görselleştirme için Protokoller

Published: April 14th, 2017

DOI:

10.3791/55519

1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Life Science Center of Tsukuba Advanced Research Alliance, University of Tsukuba, 3Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba
* These authors contributed equally

Biz diseksiyon, tespit ve steroid hormon biyosentezi ve düzenleyici mekanizma çalışmaya Drosophila larvaları ve yetişkin kadınlarda Sterpidojenik organların immün için bir protokol açıklar. steroidojenik organlara ek olarak, böyle germ çizgili kök hücreleri gibi steroidojenik organların innervasyon olarak steroidojenik hedef hücreleri görselleştirmek.

Çok hücreli organizmalarda, hücre küçük bir grup, büyüme ve üreme sistemik tepkisine sebep olarak, bunların biyojenik aktiviteye özel bir fonksiyon ile donatılmıştır. böceklerde, larva prothoracic bezi (PG) ve ekdisteoidlerden adlandırılan ana steroid hormonları-üreten mutantı ya yetişkin kadın yumurtalık oyun temel roller. Bu ecdysteroidogenic organlar biyosentezi zamanlaması çevresel işaret tarafından etkilendiğini sinir sistemi, gelen innerve. Burada steroid hormon biyosentezi ve düzenleyici mekanizma çalışmak için uygun bir model sistemi sağlar Drosophila melanogaster, sinek ecdysteroidogenic organları ve larva kendi interaktif organları ve meyve yetişkinleri görselleştirilmesi için bir protokol açıklar. Usta diseksiyon bize beynin ventral sinir kordonu ve diğer dokularda da dahil ecdysteroidogenic organların konumlarını ve interaktif organlarını korumak sağlar. Bir ile immün boyamaecdysteroidogenic enzimlerine karşı ntibodies, dokuya özel promoterler tarafından tahrik edilen transgenik floresan proteinleri ile birlikte, ecdysteroidogenic hücreleri etiketlemek için kullanılabilir. Üstelik ecdysteroidogenic organların inervasyonları da spesifik antikorların veya nöronların çeşitli GAL4 sürücülerin bir koleksiyon ile etiketli olabilir. Bu nedenle, ecdysteroidogenic organları ve nöronal bağlantıları immün ve transgenik teknikler ile eş zamanlı olarak görüntülenebilir. Son olarak, kimin çoğalması ve bakım ekdisteoidlerden tarafından kontrol edilir germ hattı kök hücreleri, görselleştirmek için nasıl açıklar. Bu yöntem steroid hormon biyosentezi ve nöronal düzenleyici mekanizmanın kapsamlı anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.

çok hücreli organizmalarda, bir grup hücre tüm vücut için gerekli olan kendi biyojenik aktivitesinde özel fonksiyonu ile donatılmıştır. görevlerini yerine getirmek için, her bir doku ya da organ işlevleri ile ilişkili genlerin bir dizi ifade eden ve gelişme bağlamında kendi faaliyetlerinin düzenlemek için başka doku ile iletişim kurar. Böyle özel hücresel fonksiyonları ve arası Organ etkileşimlerini karakterize etmek için, hücrelerin diğer türleri çok hücreli mimarisinde bozulmadan tutuluyor ile birlikte bir hücre grubu belirtmek gerekir.

Gibi özel organların bir örneği birçok biyosentetik enzimleri aktif steroid hormonları

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Not: protokolleri genel şeması Şekil 1 'de gösterilmiştir.

1. Larvaların halkası Gland Diseksiyon (RG)

NOT: D'de. cyclorrhaphous Diptera ait melanogaster, PG, bileşik endokrin organ halka bezi (RG, Şekil 2D) adı içindedir. Bu PG cerrahi (daha sonra ele alınmıştır) diğer hücre tiplerinden ayrılır, imkansız olduğu için, pratik bir hedef diseksiyon ile de dokunu.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Biz steroidogenik organları ve D. melanogaster larvaları ve yetişkin kadınlarda onların interaktif organ incelemeleri için yukarıdaki protokoller kullanılır. Protokolleri genel şeması Şekil 1 'de gösterilmiştir.

PG (Şekil 2D), beyin göre daha küçük ve daha şeffaf olduğu ve beyin (Şekil 2A-C ve 3A-E) ön-sırt tarafında yer de dahil olmak üzere, RG,. PG hücreleri etiketlemek için, çeşitli gruplar ecdysteroidogenic enzimlerine .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Biz ekdisteroid biyosentezi ve D. melanogaster düzenleyici mekanizma inceledi ve diseksiyon ve immün için bir protokol geliştirmiştir. Ekdisteroid biyosentezi zamanlaması nöronal girişler 33 boyunca çevresel olaylara etkilenir, nedenle diseksiyon sırasında beyin, VNC ve diğer dokuları ile birlikte ecdysteroidogenic organların innervasyon korumak için esastır.

Yukarıda tarif edildiği gibi, D. melanogaster PG korpus allata (C.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu iş için kendi teknik destek için Reiko Kise ve Tomotsune Ameku teşekkür ederim. Ayrıca Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, Bloomington Drosophila Stok Merkezi, KYOTO Stok Merkezi (DGRC) ve hisse senedi ve reaktifler için Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası minnettarız. Bu çalışma JSPS KAKENHI Grant Numarası 16K20945, Naito Vakfı ve Inoue Bilim Araştırma Ödülü dan ysn bağışları ile desteklenmiştir; ve mext KAKENHI Hibe Numarası 16H04792 dan RN bir hibe ile.

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
egg collection
tissue culture dish (55 mm)AS ONE1-8549-02 for grape-juice agar plates
collection cupHIKARI KAGAKU
yeast pasteOriental dry yeast, Tokyo
100% grape juiceWelch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS)SARSTEDT58.487
disposable loopAS ONE6-488-01
standard fly food the recepi us on the website of Blooington stock center.
dissection
dissecting microscopeCarl ZeissStemi 2000-C
dissecting microscopeLeicaS8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated)IWAKI1000-035
SylgardTORAYcoarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) TERUMONN-2719SA "knife" to cut the tissue
Terumo syringe,　1mlTERUMOSS-01T
forceps, Inox, #5Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter)Shiga Brandfor fillet dissection
micro scissorsNATSUME SEISAKUSHO CO LTD. MB-50-10
fixation
ultrapure waterMerck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
FormaldehydeNacalai tesque16222-65
ParaformaldehydeNacalai tesque02890-45
Triton-X100Nacalai tesque35501-15
microtubes (1.5 ml)INA OPTIKACF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker)As oneTM-300rocker
Bovine Serum AlbuminSIGMA9048-46-8
primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000Molecular ProbesA6455Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100Nakarai tesque04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500SIGMAS5545
anti-Hts 1B1 (mouse)Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20DSHBDCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50DSHBnc82
secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugateLife TechnologiesA-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugateLife TechnologiesA-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugateLife TechnologiesA-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateLife TechnologiesA-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidinLife TechnologiesA-22283
Mounting reagents
Micro slide glassMatsunami Glass Ind.,Ltd.SS7213
Square microscope cover glassMatsunami Glass Ind.,Ltd.C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent)Calbiochem345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper)WATSON5660-222-1S
imaging
LSM700 laser scanning microscope systemCarl Zeissinverted Axio Observer. Z1 SP left
image processing
LSM700 ZENCarl ZeissIt is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system
ImageJ
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4 from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFPgifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)
w; UAS-mCD8::GFP from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4 from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)

  1. Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
  2. Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
  3. Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
  4. Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
  5. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
  6. Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
  7. Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
  8. Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
  9. Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
  10. Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).
  11. Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32 (2015).
  12. Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123 (2016).
  13. Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
  14. Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O'Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
  15. Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O'Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
  16. Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
  17. Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
  18. Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
  19. McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
  20. Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778 (2014).
  21. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
  22. Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
  23. Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
  24. Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
  25. Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
  26. Parvy, J. -. P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
  27. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  28. Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
  29. Li, H. -. H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
  30. Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806 (2010).
  31. Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
  32. Song, X., Zhu, C. -. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
  33. Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
  34. Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
  35. Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
  36. Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712 (2015).
  37. Yamanaka, N., Marqués, G., O'Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
  38. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
  39. Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211 (2015).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved