En all-on-chip metode til hurtig neutrofile kemotaxis analyse direkte fra en bloddråbe

Denne artikel tilvejebringer den detaljerede fremgangsmåde til at udføre en hurtig neutrofile kemotaxis-analyse ved at integrere on-chip-neutrofilisoleringen fra helblod og kemotaxis-testen på en enkelt mikrofluidisk chip.

Neutrofile migration og kemotaks er afgørende for vores krops immunsystem. Mikrofluidiske enheder anvendes i stigende grad til undersøgelse af neutrofilmigration og kemotaxis på grund af deres fordele ved real-time visualisering, præcis styring af kemisk koncentrationsgradientgenerering og reduceret reagens- og prøveforbrug. For nylig er der gjort en stigende indsats fra de mikrofluidiske forskere mod udvikling af integrerede og let betjente mikrofluidiske kemotaxisanalysesystemer direkte fra helblod. I denne retning blev den første all-on-chip-metode udviklet til integration af den magnetiske negative oprensning af neutrofiler og kemotaxisassayet fra små blodvolumenprøver. Denne nye metode tillader en hurtig prøve-til-resultat-neutrofile kemotaxis-test i 25 minutter. I dette papir leverer vi detaljeret konstruktion, drift og dataanalysemetode til denne all-on-chip chemotaxis-analyse med en diskussion om fejlfindingsstrategier, limiTationer og fremtidige retninger. Repræsentative resultater af den neutrofil-kemotaxis-analyse, der tester en defineret kemoattraktant, N- formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) og sputum fra en patient med kronisk obstruktiv lungesygdom (COPD), under anvendelse af denne all-on-chip-metode, er vist. Denne metode er anvendelig til mange celle migrationsrelaterede undersøgelser og kliniske anvendelser.

Chemotaxis, en proces med rettet cellemigration til opløselig kemisk koncentrationsgradient, er kritisk involveret i mange biologiske processer, herunder immunrespons ^{1 , 2 , 3} , vævsudvikling ⁴ og cancermetastase ⁵ . Neutrofiler er den mest almindelige hvide blodlegemsundergruppe og spiller afgørende roller for at muliggøre kroppens medfødte værtsforsvarsfunktioner samt til formidling af adaptive immunresponser ^{6 , 7} . Neutrofiler er udstyret med højtregulerede kemotak....

Alle humane prøveindsamlingsprotokoller blev godkendt af Det Etiske Fakultet for Forskningsetik ved University of Manitoba, Winnipeg.

1. Fremstilling af mikrofluidiske enheder ( figur 1A )

1. Design og udskrifts gennemsigtighedsmaske.
   1. Design enheden som beskrevet tidligere ²⁵ . Se figur 1A .
      BEMÆRK: Enheden indeholder to lag. Det første lag (4 μm høje) definerer c.......

Neutrofile selekteres negativt fra en dråbe fuldblod direkte i den mikrofluide enhed. Renheden af ​​de isolerede neutrofiler blev verificeret ved on-chip Giemsa-farvning, og resultaterne viste de typiske ringformede og lobeformede kerner af neutrofiler ( figur 2A ) ²⁵ . Dette indikerer en effektiv neutrofile isolering på chip ved høj renhed fra et lille volumen af ​​helblod. Endvidere kan dockningsstrukturen effektivt juste.......

I dette dokument blev der beskrevet en detaljeret protokol til direkte isolering af neutrofile fra fuldblod efterfulgt af kemotaxis-testen, alt på en enkelt mikrofluidisk chip. Denne metode giver nyttige funktioner i sin nemme drift, negativt udvalg af neutrofiler med høj renhed, hurtig prøve-til-resultat kemotaxis-test, reducerede reagenser og prøveforbrug og nøjagtig analyse af celleoverførselsdata. Som et groft skøn indlæsede mindst 25% af neutrofilerne fra den indgående helblodprøve effektivt dockningsstru.......

Dette arbejde støttes delvist af stipendier fra Canadas Naturvidenskabsforskningsråd (NSERC) og de canadiske institutter for sundhedsforskning (CIHR). Vi takker Det Kliniske Institut for Anvendt Forskning og Uddannelse på Victoria General Hospital i Winnipeg og Seven Oaks General Hospital i Winnipeg til styring af kliniske prøver fra mennesker. Vi takker Dr. Hagit Peretz-Soroka for en god diskussion om analyseprocessen. Vi takker professor Carolyn Ren og Dr. Xiaoming (Cody) Chen fra University of Waterloo for deres generøse støtte i filmen.