JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Immunology and Infection

Метод «все на кристалле» для быстрого анализа хемотаксиса нейтрофилов непосредственно из капли крови

Published: June 23rd, 2017

DOI:

10.3791/55615

1Institute of Applied Technology, Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Sciences, 2University of Science and Technology of China, 3Department of Physics and Astronomy, University of Manitoba, 4Department of Biosystems Engineering, University of Manitoba, 5Seven Oaks General Hospital, 6Department of Immunology, University of Manitoba, 7Department of Biological Sciences, University of Manitoba
* These authors contributed equally

В этой статье представлен подробный метод проведения быстрого анализа хемотаксиса нейтрофилов путем интеграции изоляции нейтрофилов на кристалле из цельной крови и теста на хемотаксис на одном микрожидкостном чипе.

Нейтрофильная миграция и хемотаксис являются критическими для иммунной системы нашего организма. Микрофлюидные устройства все чаще используются для исследования миграции нейтрофилов и хемотаксиса из-за их преимуществ в визуализации в реальном времени, точного контроля образования градиента концентрации химических веществ и снижения потребления реагентов и проб. В последнее время микрофлюидные исследователи предпринимают все более активные усилия по разработке интегрированных и легко управляемых систем микрофлюидного хемотаксиса непосредственно из цельной крови. В этом направлении был разработан первый метод «все на кристалле» для интеграции магнитной отрицательной очистки нейтрофилов и анализа хемотаксиса с образцами небольших объемов крови. Этот новый метод позволяет быстро провести анализ хемотаксиса нейтрофилов с образцом к результату через 25 мин. В этой статье мы предлагаем подробный метод построения, эксплуатации и анализа данных для этого анализа хемотаксиса на чипе с обсуждением стратегий устранения неисправностей, limiИ будущие направления. Показаны репрезентативные результаты анализа хемотаксиса нейтрофилов, в которых анализируется определенный хемоаттрактант, N- Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) и мокрота у пациента с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) с использованием этого метода «все на кристалле». Этот метод применим ко многим исследованиям, связанным с миграцией клеток и клиническим применениям.

Хемотаксис, процесс направленной миграции клеток в растворимый градиент концентрации химических веществ, критически участвует во многих биологических процессах, включая иммунный ответ 1 , 2 , 3 , развитие тканей 4 и метастазы рака 5 . Нейтрофилы являются наиболее распространенным подсемейством лейкоцитов и играют решающую роль в обеспечении врожденных функций защиты организма в целом, а также в опосредовании адаптивных иммунных реакций 6 , 7 . Нейтрофилы снабжены высоко....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все протоколы сбора образцов человека были одобрены советом по этике научных исследований в Университете Манитобы, Виннипег.

1. Изготовление микрожидкостного устройства ( рисунок 1А )

  1. Маска прозрачности и печати.
    1. Создайте устройство, .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Нейтрофилы отрицательно выбраны из капли цельной крови непосредственно в микрожидкостное устройство. Чистота изолированных нейтрофилов была подтверждена окрашиванием на кристалле Гимса, и результаты показали типичные кольцеобразные и лопастные ядра нейтрофилов (.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В этой статье был описан подробный протокол для непосредственного выделения нейтрофилов из цельной крови, за которым следует тест хемотаксиса, все на одном микрожидкостном чипе. Этот метод предлагает полезные функции в его простой работе, отрицательный отбор высокочистых нейтрофило?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Эта работа частично поддерживается грантами из Совета по исследованиям естественных наук и инженерных исследований Канады (NSERC) и Канадских институтов исследований в области здравоохранения (CIHR). Мы благодарим Клинический институт прикладных исследований и образования в Большом госпитале Виктории в Виннипеге и Госпитале Семь Оукс в Виннипеге для управления клиническими образцами от людей. Мы благодарим доктора Хагита Переца-Сороку за полезную дискуссию о стратегиях операции анализа. Мы благодарим профессора Каролин Рен и доктора Сяоминя (Коди) Чена из Университет....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
Device fabrication
Mask alignerABMN/A
SpinnerSolitec5000
HotplateVWR11301-022
Plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-001
Vacuum dessicatorFisher Scientific08-594-15A
Digital scaleOhausCS200
SU-8 2000 thinnerMicrochemSU-8 2000
SU-8 2025 photoresistMicrochemSU-8 2025
SU-8 developerMicrochemSU-8 developer
Si waferSilicon, IncLG2065
isopropyl alcoholFisher ScientificA416-4
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilaneGelest78560-45-9
Polydimethylsiloxane
(PDMS)		Ellsworth Adhesives2065622
Petri DishFisher ScientificFB0875714
Glass slidesFisher Scientific12-544-4
Cutting padN/AN/ACustom-made
PunchersN/AN/ACustom-made
Name SourceCatalog NumberComments
On-chip cell isolation and chemotaxis assay
RPMI 1640Fisher ScientificSH3025502
DPBSFisher ScientificSH3002802
Bovine serum albumin
(BSA)		Sigma-AldrichSH3057402
FibronectinVWRCACB356008
fMLPSigma-AldrichF3506-10MG
Magnetic disksIndigo Instruments44202-15 mm in diameter,
1 mm thick
FITC-DextranSigma-AldrichFD10S
Rhodamine
Sigma-Aldrich		R4127-5G
Giemsa stain solutionRowley Biochemical Inc.G-472-1-8OZ
EasySep Direct Human
Neutrophil Isolation
Kit		STEMCELL
Technologies Inc		19666
DithiothreitolSigma-AldrichD0632
Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope NikonTi-U
Microscope environmental chamber.InVivo ScientificN/A
CCD cameraNikonDS-Fi1

  1. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (13), 159-175 (2013).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat Immunol. 6 (12), 1182-1190 (2005).
  3. Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
  4. Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132 (4), 612-630 (2008).
  5. Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).
  6. Kruger, P., et al. Neutrophils: between host defence, immune modulation, and tissue injury. PLoS Pathog. 11 (3), e1004651 (2015).
  7. Mócsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. J Exp Med. 210 (7), 1283-1299 (2013).
  8. Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis. J Cell Biol. 139 (7), 1349-1360 (1997).
  9. Tazzyman, S., Niaz, H., Murdoch, C. Neutrophil-mediated tumour angiogenesis: subversion of immune responses to promote tumour growth. Semin Cancer Biol. 23 (3), 149-158 (2013).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).
  11. Wu, J., Wu, X., Lin, F. Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies. Lab Chip. 13 (13), 2484-2499 (2013).
  12. Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
  13. Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. Biological applications of microfluidic gradient devices. Integr Biol. 2 (11-12), 584-603 (2010).
  14. Irimia, D., et al. Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients. Lab Chip. 6 (2), 191-198 (2006).
  15. Lin, F., et al. Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices. Ann Biomed Eng. 33 (4), 475-482 (2005).
  16. Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels. Integr Biol. 2 (11-12), 639-647 (2010).
  17. Jones, C. N., et al. Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns. PloS One. 9 (12), e114509 (2014).
  18. Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS One. 5 (7), e11921 (2010).
  19. Wu, J., et al. A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients. PloS One. 10 (5), e0126523 (2015).
  20. Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120 (14), e45-e53 (2012).
  21. Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab Chip. 8 (12), 2054-2061 (2008).
  22. Jones, C. N., et al. Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood. J Vis Exp. (88), (2014).
  23. Jones, C. N., et al. Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets. J Leukocyte Biol. 100 (1), 241-247 (2016).
  24. Sackmann, E. K. -. H., et al. Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis. P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).
  25. Wu, J., et al. An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient's sputum. Technology. 04 (02), 104-109 (2016).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved