En allt-på-chip-metod för snabb neutrofilkemotaxisanalys direkt från en bloddroppe

Denna artikel tillhandahåller den detaljerade metoden för att utföra en snabb neutrofil-kemotaxisanalys genom att integrera den neutrofila isolationen på chip från helblod och kemotaxistestet på en enda mikrofluidisk chip.

Neutrofil migration och kemotax är kritiska för vår kropps immunsystem. Mikrofluidiska enheter används alltmer för att undersöka neutrofilmigration och kemotaxor på grund av deras fördelar i realtidsvisualisering, exakt kontroll av kemisk koncentrationsgradientgenerering och minskad reagens- och provförbrukning. Nyligen har mikrofluidiska forskare gjort en ökande insats för att utveckla integrerade och lättanvända mikrofluidiska kemotaxisanalyssystem, direkt från helblod. I denna riktning utvecklades den första all-on-chip-metoden för att integrera den magnetiska negativa reningen av neutrofiler och kemotaxisanalysen från små blodvolymprover. Denna nya metod medger ett snabbt prov-till-resultat neutrofilt kemotaxistest på 25 min. I det här dokumentet tillhandahåller vi detaljerad konstruktion, drift och data analysmetod för denna allt-på-chip kemotaxis analys med en diskussion om felsökningsstrategier, limiTationer och framtida riktningar. Representativa resultat av den neutrofila kemotaxisanalys som testar en definierad kemoattraktant, N- formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) och sputum från en patient med kronisk obstruktiv lungsjukdom (COPD) med användning av denna all-on-chip-metod visas. Denna metod är tillämplig på många cellmigrationsrelaterade undersökningar och kliniska tillämpningar.

Chemotaxis, en process med riktad cellmigrering till löslig kemisk koncentrationsgradient, är kritiskt inblandad i många biologiska förfaranden inklusive immunsvar ^{1 , 2 , 3} , vävnadsutveckling ⁴ och cancermetastas ⁵ . Neutrofiler är den vanligaste vita blodkroppsuppsättningen och spelar viktiga roller för att möjliggöra kroppens medfödda värdförsvarsfunktioner, samt för att förmedla adaptiva immunsvar ^{6 , 7} . Neutrofiler är utrustade med högreglerade kemotaktiska maski....

Alla samlingsprotokoll för mänskliga provtagning godkändes av den gemensamma fakultetsforskningsetikstyrelsen vid University of Manitoba, Winnipeg.

1. Tillverkning av mikrofluidiska anordningar ( figur 1A )

1. Design och skriva ut transparensmask.
   1. Konstruera enheten enligt detaljerad tidigare ²⁵ . Se figur 1A .
      OBS! Enheten innehåller två lager. Det första lagret.......

Neutrofiler väljs negativt från en droppe helblod direkt i den mikrofluidiska enheten. Renheten hos de isolerade neutrofilerna verifierades genom on-chip Giemsa-färgning och resultaten visade de typiska ringformade och lobeformade kärnorna av neutrofiler ( Figur 2A ) ²⁵ . Detta indikerar en effektiv neutrofilt isolering på chip vid hög renhet från en liten volym helblod. Vidare kan dockningsstrukturen effektivt placera cellerna.......

I detta dokument beskrivs ett detaljerat protokoll för direkt isolering av neutrofiler från helblod följt av kemotaxistestet, allt på ett enda mikrofluidiskt chip. Denna metod erbjuder användbara funktioner i sin lätta operation, negativt urval av neutrofiler med hög renhet, snabbt prov-till-resultat-kemotaxistest, reducerade reagenser och provkonsumtion och exakt cellmigrationsdataanalys. Som en grov uppskattning kom minst 25% av neutrofilerna från det ingående helblodprovet effektivt in i dockningsstrukturen .......

Detta arbete stöds delvis av bidrag från Canadian Science and Engineering Research Council (NSERC) och de kanadensiska instituten för hälsoforskning (CIHR). Vi tackar det kliniska institutet för tillämpad forskning och utbildning vid Victoria General Hospital i Winnipeg och Seven Oaks General Hospital i Winnipeg för att hantera kliniska prover från mänskliga ämnen. Vi tackar Dr. Hagit Peretz-Soroka för en bra diskussion om analysoperationsstrategierna. Vi tackar professor Carolyn Ren och Dr. Xiaoming (Cody) Chen från University of Waterloo för deras generösa stöd i f....