Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
Bu makale, tam kandan alınan çipte nötrofil izolasyonunu ve kemotaks testini tek bir mikroakışkan yonga üzerine entegre ederek hızlı bir nötrofıl kemotaksis tahlilini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir yöntem sunmaktadır.
Nötrofil göçü ve kemotaksis, vücudumuzun bağışıklık sistemi için kritik öneme sahiptir. Mikroakışkan cihazlar, gerçek zamanlı görselleştirme, kimyasal konsantrasyon gradyanı üretiminin hassas kontrolü ve reaktif ve numune tüketiminin azaltılması gibi avantajlarından ötürü nötrofil göçünü ve kemotaksiyi araştırmak için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Son zamanlarda, doğrudan doğruya kandan, mikroakışkan araştırmacılar tarafından entegre ve kolaylıkla çalıştırılan mikroakışkan kemotaks analizi sistemlerine yönelik büyüyen bir çaba gösterildi. Bu yönde, nötrofillerin manyetik negatif arıtımını ve küçük kan hacmi numunelerindeki kemotaksis tahlilini bütünleştirmek için ilk all-on-chip yöntemi geliştirildi. Bu yeni yöntem, 25 dakika içinde hızlı numune-sonuç nötrofil kemotaksisi testine izin verir. Bu yazıda, sorun giderme stratejileri üzerine bir tartışma ile bu all-on-chip chemotaxis tahlilinin detaylı inşası, işletimi ve veri analizi yöntemi sunulmaktadır.Tations ve gelecekteki yönergeler. Tanımlanmış bir kemoatraktan, N -Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) hastasından alınan balgamın bu all-on-chip yöntemini kullanarak test eden nötrofil kemotaksis testinin temsilci sonuçları gösterilmiştir. Bu yöntem birçok hücre göçüyle ilgili araştırmalar ve klinik uygulamalar için geçerlidir.
Kemotaksis, çözünür kimyasal konsantrasyon gradiyentine yönlendirilmiş bir hücre migrasyon süreci, bağışıklık yanıtı 1 , 2 , 3 , doku gelişimi 4 ve kanser metastazı 5 dahil olmak üzere birçok biyolojik proseste kritik rol oynar. Nötrofiller, en bol beyaz kan hücresi altkümesidir ve vücudun doğal konakçı savunma işlevlerinin sağlanmasında, ayrıca adaptif bağışıklık yanıtlarının düzenlenmesinde 6 , 7 önemli rol oynamaktadır. Nötrofiller, bu hareketli bağışıklık hücrelerin....
Tüm insan numunesi toplama protokolleri, Winnipeg Manitoba Üniversitesi'nde Ortak Fakülte Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylandı.
1. Mikroakışkan Cihaz Üretimi ( Şekil 1A )
Nötrofiller mikroflüidik aygıta doğrudan tam damla bir damla seçilir. İzole edilmiş nötrofillerin saflığı çip üzerinde Giemsa boyaması ile doğrulandı ve sonuçlar nötrofillerin tipik halka şeklindeki ve lob şeklindeki çekirdeklerini gösterdi ( Şekil 2A ) 25 . Bu, küçük bir hacimdeki tüm kandan yüksek saflıkta etkili bir çipte nötrofil izolasyonu olduğunu gösterir. Ayrıca, yerleştirme yapısı, kimyasa.......
Bu yazıda, doğrudan tek bir mikroakışkan yonga üzerinde kemotaksis testi ile tam kandan nötrofilleri doğrudan izole etmek için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem, kolay çalışması, yüksek saflıktaki nötrofillerin negatif seçimi, hızlı numuneden sonuç toplayan kemotaks testi, indirgenmiş reaktifler ve numune tüketimi ve doğru hücre göç verileri analizi için yararlı özellikler sunar. Kaba bir tahmini olarak, giren tam kan örneğindeki nötrofillerin en az% 25'i aygıtt.......
Bu çalışma kısmen Kanada Doğal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitülerinden (CIHR) hibeler tarafından desteklenmektedir. Winnipeg'daki Victoria Genel Hastanesi'ndeki Uygulamalı Araştırma ve Eğitim Klinik Enstitüsüne ve Winnipeg'taki Seven Oaks Genel Hastanesine, insan deneklerinden klinik örnekleri yönettikleri için teşekkür ediyoruz. Tahlil operasyon stratejileri hakkında yararlı tartışmalar için Dr. Hagit Peretz-Soroka'ya teşekkür ederiz. Çekimler sürecine cömertçe destek verdikleri için Waterloo Ü....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Device fabrication | |||
Mask aligner | ABM | N/A | |
Spinner | Solitec | 5000 | |
Hotplate | VWR | 11301-022 | |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
Vacuum dessicator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
Digital scale | Ohaus | CS200 | |
SU-8 2000 thinner | Microchem | SU-8 2000 | |
SU-8 2025 photoresist | Microchem | SU-8 2025 | |
SU-8 developer | Microchem | SU-8 developer | |
Si wafer | Silicon, Inc | LG2065 | |
isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-4 | |
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane | Gelest | 78560-45-9 | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | 2065622 | |
Petri Dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
Cutting pad | N/A | N/A | Custom-made |
Punchers | N/A | N/A | Custom-made |
Name | Source | Catalog Number | Comments |
On-chip cell isolation and chemotaxis assay | |||
RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH3025502 | |
DPBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | SH3057402 | |
Fibronectin | VWR | CACB356008 | |
fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
Magnetic disks | Indigo Instruments | 44202-1 | 5 mm in diameter, 1 mm thick |
FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD10S | |
Rhodamine | Sigma-Aldrich | R4127-5G | |
Giemsa stain solution | Rowley Biochemical Inc. | G-472-1-8OZ | |
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | STEMCELL Technologies Inc | 19666 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope | Nikon | Ti-U | |
Microscope environmental chamber. | InVivo Scientific | N/A | |
CCD camera | Nikon | DS-Fi1 |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved