Real-time iontophorese med tetramethylammonium til kvantificering af volumen fraktion og tortuosity af hjernens ekstracellulære rum

Denne protokol beskriver realtids-iontoforese, en metode, som måler fysiske parametre for hjernens ekstracellulære rum (ECS). Diffusionen af ​​et inert molekyle, der frigives i ECS, anvendes til at beregne ECS-volumenfraktionen og tortuositeten. Det er ideelt til at studere akut reversible ændringer i hjernens ECS.

Denne gennemgang beskriver de grundlæggende begreber og protokollen til at udføre realtids-iontoforese-metoden (GTI), guldstandarden til at udforske og kvantificere det ekstracellulære rum (ECS) i den levende hjerne. ECS omgiver alle hjerneceller og indeholder både interstitiel væske og ekstracellulær matrix. Transporten af ​​mange stoffer, der kræves til hjernens aktivitet, herunder neurotransmittere, hormoner og næringsstoffer, sker ved diffusion gennem ECS. Ændringer i volumen og geometri i dette rum forekommer under normale hjerneprocesser, som søvn og patologiske tilstande, som iskæmi. Men strukturen og reguleringen af ​​hjerne ECS, især i syge stater, forbliver stort set uudforsket. RTI-metoden måler to fysiske parametre af levende hjerne: volumenfraktion og tortuositet. Volumenfraktion er andelen af ​​vævsvolumen optaget af ECS. Tortuosity er et mål for den relative hindring, et stof møder, når det diffunderer gennem en hjerne reGion i forhold til et medium uden forhindringer. I RTI pulses et inert molekyle fra en kilde-mikroelektrode til hjernens ECS. Da molekyler diffunderer væk fra denne kilde, måles den ændrede koncentration af ionet over tid ved anvendelse af en ion-selektiv mikroelektrode placeret omtrent 100 μm væk. Fra den resulterende diffusionskurve kan både volumenfraktion og tortuositet beregnes. Denne teknik er blevet brugt i hjerneskiver fra flere arter (herunder mennesker) og in vivo for at studere akutte og kroniske ændringer i ECS. I modsætning til andre metoder kan RTI bruges til at undersøge både reversible og irreversible ændringer i hjernens ECS i realtid.

Det ekstracellulære rum (ECS) er netværket af indbyrdes forbundne kanaler udvendigt til alle hjerneceller og indeholder både interstitiell væske og ekstracellulær matrix ( figur 1a og figur 1b ). Fordelingen af ​​mange stoffer, der kræves til hjernecellens funktion, herunder næringsstoffer, hormoner og neurotransmittere, forekommer ved diffusion gennem ECS. Ændringer i de fysiske parametre i dette rum, herunder volumen, geometri og ekstracellulær matrix, kan drastisk påvirke diffusion gennem ECS og de lokale ionkoncentrationer, badinghjerneceller, som har en dybtgående indvirkning på hjernecellens funk....

Alle dyreprocedurer, der bruges til at opnå vævsprøver, blev godkendt af dyreetikudvalget ved SUNY Downstate Medical Center.

1. Fremstilling af løsninger og udstyr

1. Forbered en 150 mM NaCl-påfyldningsopløsning til ISM's referencebeholder. Opbevares i en 10 ml sprøjte, der er fastgjort til et 0,22 μm filter (for at fjerne bakterier eller partikler).
2. Forbered en 150 mM TMA chlorid (TMA-Cl) -fyldningsopløsning for mikroelektroderne. Opbevares i en 10 ml sprøjte.......

Anvendelsen af ​​RTI-teknikken er demonstreret i et eksperiment designet til at måle ændringerne i a og under en hypoosmolær udfordring ( figur 8 og figur 9 ). Det har tidligere vist sig, at reduktion af osmolariteten af ​​ECS ved vask på hypotonisk ACSF vil medføre et fald i α og en stigning i λ ¹³ .

I.......

Figur 10: Ikke-ideelle data, der viser almindelige tekniske problemer. ( A ) Diagrammer af fælles tekniske problemer med iontofores mikroelektroder: Sammenligning af den normale frigivelse af TMA fra en fungerende iontofores mikroelektrode med tre kilder, der viser tekniske problemer. [Høj forstørrelse, a1] Strømmen i en ideel iontoforetisk kilde bæres lige ved TMA frigivelse og chloridoptagels.......

Arbejdet blev støttet af NIH NINDS tilskud R01 NS047557.