Echtzeit-Iontophorese mit Tetramethylammonium zur Quantifizierung der Volumenfraktion und Tortuosität des Gehirns extrazellulären Raumes

Dieses Protokoll beschreibt Echtzeit-Iontophorese, eine Methode, die physikalische Parameter des extrazellulären Raumes (ECS) des lebenden Gehirns misst. Die Diffusion eines in das ECS freigesetzten Inertmoleküls wird zur Berechnung des ECS-Volumenanteils und der Tortuosität herangezogen. Es ist ideal für das Studium akuter reversibler Änderungen an Gehirn ECS.

Diese Übersicht beschreibt die grundlegenden Konzepte und das Protokoll zur Durchführung der Echtzeit-Iontophorese (RTI) -Methode, die Gold-Standard, um den extrazellulären Raum (ECS) des lebenden Gehirns zu erforschen und zu quantifizieren. Die ECS umgibt alle Gehirnzellen und enthält sowohl interstitielle Flüssigkeit als auch extrazelluläre Matrix. Der Transport von vielen Substanzen, die für die Gehirnaktivität erforderlich sind, einschließlich Neurotransmitter, Hormone und Nährstoffe, erfolgt durch Diffusion durch die ECS. Änderungen des Volumens und der Geometrie dieses Raumes treten bei normalen Gehirnprozessen, wie Schlaf und pathologischen Zuständen, wie Ischämie, auf. Allerdings bleibt die Struktur und Regulierung des Gehirns ECS, vor allem in kranken Staaten, weitgehend unerforscht. Die RTI-Methode misst zwei physikalische Parameter des lebenden Gehirns: Volumenbruch und Tortuosität. Volumenanteil ist der Anteil des von ECS besetzten Gewebevolumens. Tortuosität ist ein Maß für die relative Hinderung, die eine Substanz beim Diffundieren durch ein Gehirn bekommtGion im Vergleich zu einem Medium ohne Hindernisse. In RTI wird ein inertes Molekül aus einer Quellenmikroelektrode in das Gehirn ECS gepulst. Da sich die Moleküle von dieser Quelle weg diffundieren, wird die sich ändernde Konzentration des Ions über die Zeit mit einer ionenselektiven Mikroelektrode gemessen, die etwa 100 μm entfernt ist. Aus der resultierenden Diffusionskurve können sowohl Volumenanteil als auch Tortuosität berechnet werden. Diese Technik wurde in Gehirnscheiben von mehreren Arten (einschließlich Menschen) und in vivo verwendet , um akute und chronische Veränderungen an ECS zu untersuchen. Im Gegensatz zu anderen Methoden kann RTI verwendet werden, um sowohl reversible als auch irreversible Änderungen des Gehirns ECS in Echtzeit zu untersuchen.

Der extrazelluläre Raum (ECS) ist das Netzwerk von miteinander verbundenen Kanälen außerhalb aller Gehirnzellen und enthält sowohl interstitielle Flüssigkeit als auch extrazelluläre Matrix ( Abbildung 1a und Abbildung 1b ). Die Verteilung von vielen Substanzen, die für die Gehirnzellfunktion erforderlich sind, einschließlich Nährstoffe, Hormone und Neurotransmitter, erfolgt durch Diffusion durch die ECS. Änderungen der physikalischen Parameter dieses Raumes, einschließlich Volumen, Geometrie und extrazelluläre Matrix, können die Diffusion durch die ECS und die lokalen Ionenkonzentrationen, die Gehirnze....

Alle Tierverfahren, die verwendet wurden, um Gewebeproben zu erhalten, wurden von der Tierethik-Komitee im SUNY Downstate Medical Center genehmigt.

1. Vorbereitung von Lösungen und Geräten

1. Bereiten Sie eine 150 mM NaCl-Hinterfüllungslösung für den Referenztubus des ISM vor. Lagern Sie es in einer 10 ml Spritze, die an einem 0,22 μm Filter befestigt ist (um Bakterien oder Partikel zu entfernen).
2. Vorbereiten einer 150 mM TMA-Chlorid (TMA-Cl) -Verfüllung für die Mik.......

Der Nutzen der RTI-Technik wird in einem Experiment demonstriert, das entworfen ist, um die Änderungen in α und während einer hypoosmolaren Herausforderung zu messen ( Abbildung 8 und Abbildung 9 ). Es wurde bereits gezeigt, dass die Verringerung der Osmolarität des ECS durch Waschen auf hypotonischem ACSF eine Abnahme von & agr; und eine Erhöhung von & lgr; ¹³ bewi.......

Abbildung 10: Nicht-ideale Daten, die gemeinsame technische Probleme demonstrieren. ( A ) Diagramme allgemeiner technischer Fragen mit Iontophorese-Mikroelektroden: Vergleich der normalen Freisetzung von TMA aus einer funktionierenden Iontophorese-Mikroelektrode mit drei Quellen, die technische Probleme zeigen. [Hohe Vergrößerung, a1] Der Strom in einer idealen iontophoretischen Quelle wird gl.......

Die Arbeit wurde von NIH NINDS bewilligt R01 NS047557 unterstützt.