Real-time Iontophoresis med tetrametylammonium for å kvantifisere volumfraksjon og tortuositet i hjernens ekstracellulære rom

Denne protokollen beskriver sanntids-iontoforese, en metode som måler fysiske parametere for det ekstracellulære rommet (ECS) av levende hjerner. Spredningen av et inert molekyl som slippes i ECS, brukes til å beregne ECS volumfraksjonen og tortuositeten. Det er ideelt for å studere akut reversible endringer i hjerne ECS.

Denne anmeldelsen beskriver de grunnleggende konseptene og protokollen for å utføre realtids iontoforese-metoden (GI), gullstandarden for å undersøke og kvantifisere det ekstracellulære rommet (ECS) av levende hjerne. ECS omgir alle hjerneceller og inneholder både interstitiell væske og ekstracellulær matrise. Transport av mange stoffer som kreves for hjernens aktivitet, inkludert nevrotransmittere, hormoner og næringsstoffer, skjer ved diffusjon gjennom ECS. Endringer i volum og geometri i dette rommet forekommer under normale hjerneprosesser, som søvn og patologiske forhold, som iskemi. Men strukturen og reguleringen av hjernen ECS, særlig i sykdommer, forblir stort sett uutforsket. RTI-metoden måler to fysiske parametere av levende hjerne: volumfraksjon og tortuositet. Volumfraksjon er andelen av vevvolumet okkupert av ECS. Tortuosity er et mål på den relative hindringen et stoff møter når det diffunderes gjennom hjernenGion i forhold til et medium uten hindringer. I RTI pulses et inert molekyl fra en kilde-mikroelektrode til hjernen ECS. Som molekyler diffunderer vekk fra denne kilden, måles den skiftende konsentrasjonen av ionet over tid ved å bruke en ion-selektiv mikroelektrode plassert omtrent 100 μm unna. Fra den resulterende diffusjonskurven kan både volumfraksjon og tortuositet beregnes. Denne teknikken har blitt brukt i hjerneskiver fra flere arter (inkludert mennesker) og in vivo for å studere akutte og kroniske endringer i ECS. I motsetning til andre metoder kan RTI brukes til å undersøke både reversible og irreversible endringer i hjernens ECS i sanntid.

Det ekstracellulære rommet (ECS) er nettverket av sammenkoblede kanaler utvendig til alle hjerneceller og inneholder både interstitialvæske og ekstracellulær matrise ( figur 1a og figur 1b ). Fordelingen av mange stoffer som kreves for hjernecellens funksjon, inkludert næringsstoffer, hormoner og nevrotransmittere, oppstår ved diffusjon gjennom ECS. Endringer i de fysiske parametrene til dette rommet, inkludert volum, geometri og ekstracellulær matrise, kan drastisk påvirke diffusjon gjennom ECS og de lokale ionkonsentrasjonsbadinghjerneceller, som har en dyp innvirkning på hjernecellens funksjon

Alle dyreprosedyrer, som brukes til å oppnå vevsprøver, ble godkjent av dyreetikkutvalget ved SUNY Downstate Medical Center.

1. Fremstilling av løsninger og utstyr

1. Klargjør en 150 mM NaCl-fyllingsløsning for referansekranen til ISM. Oppbevar den i en 10 ml sprøyte festet til et 0,22 μm filter (for å fjerne bakterier eller partikler).
2. Forbered en 150 mM TMA klorid (TMA-Cl) påfyllingsløsning for mikroelektroder. Oppbevar den i en 10 ml sprøyte festet til et 0,2.......

Utnyttelsen av RTI-teknikken er demonstrert i et eksperiment designet for å måle endringene i a og under en hypoosmolær utfordring ( figur 8 og figur 9 ). Det har tidligere blitt vist at redusering av osmolariteten til ECS ved vask på hypotonisk ACSF vil gi en reduksjon i α og en økning i λ ¹³ .

I dette forsøk.......

Figur 10: Ikke-ideelle data som demonstrerer vanlige tekniske problemer. ( A ) Diagrammer av vanlige tekniske problemer med iontophores mikroelektroder: Sammenligning av normal frigivelse av TMA fra en fungerende iontoforese mikroelektrode med tre kilder som viser tekniske problemer. [Høy forstørrelse, a1] Strømmen i en ideell iontoforetisk kilde bæres like ved TMA-frigivelse og kloridopptak. [H.......

Arbeidet ble støttet av NIH NINDS stipend R01 NS047557.