Itoforese em tempo real com tetrametilamônio para quantificar fração de volume e tortuosidade do espaço extracelular cerebral

Este protocolo descreve a iontoforese em tempo real, um método que mede os parâmetros físicos do espaço extracelular (ECS) dos cérebros vivos. A difusão de uma molécula inerte liberada no ECS é utilizada para calcular a fração de volume ECS e tortuosidade. É ideal para estudar alterações reversíveis agudas na ECS cerebral.

Esta revisão descreve os conceitos e protocolos básicos para executar o método de iontoforese em tempo real (RTI), o padrão-ouro para explorar e quantificar o espaço extracelular (ECS) do cérebro vivo. O ECS envolve todas as células cerebrais e contém fluido intersticial e matriz extracelular. O transporte de muitas substâncias necessárias para a atividade cerebral, incluindo neurotransmissores, hormônios e nutrientes, ocorre por meio da difusão através do ECS. Mudanças no volume e geometria deste espaço ocorrem durante processos cerebrais normais, como o sono e condições patológicas, como a isquemia. No entanto, a estrutura e a regulação das ECS cerebrais, particularmente em estados doentes, permanecem largamente inexploradas. O método RTI mede dois parâmetros físicos do cérebro vivo: fração volumétrica e tortuosidade. A fração de volume é a proporção de volume de tecido ocupado pela ECS. A tortuosidade é uma medida do impedimento relativo que uma substância encontra ao difundir através de um cérebro reEm comparação com um meio sem obstruções. Em RTI, uma molécula inerte é pulsada a partir de um microeletrodo de origem no ECS do cérebro. À medida que as moléculas se difundem para longe desta fonte, a mudança da concentração do íon é medida ao longo do tempo usando um microeletrodo seletivo de íons, localizado a aproximadamente 100 um de distância. A partir da curva de difusão resultante, tanto a fração de volume quanto a tortuosidade podem ser calculadas. Esta técnica tem sido utilizada em fatias de cérebro de múltiplas espécies (incluindo seres humanos) e in vivo para estudar alterações agudas e crônicas para ECS. Ao contrário de outros métodos, RTI pode ser usado para examinar mudanças reversíveis e irreversíveis no ECS do cérebro em tempo real.

O espaço extracelular (ECS) é a rede de canais interligados para todas as células cerebrais e contém fluido intersticial e matriz extracelular ( Figura 1a e Figura 1b ). A distribuição de muitas substâncias necessárias para a função das células cerebrais, incluindo nutrientes, hormônios e neurotransmissores, ocorre por difusão através da ECS. As mudanças nos parâmetros físicos deste espaço, incluindo o volume, a geometria e a matriz extracelular, podem afetar drasticamente a difusão através do ECS e as concentrações de íons locais que banham as células cerebrais, que têm um impacto profundo na função c....

Todos os procedimentos de animais, usados ​​para obter amostras de tecido, foram aprovados pelo comitê de ética animal no SUNY Downstate Medical Center.

1. Preparação de soluções e equipamentos

1. Prepare uma solução de enchimento de NaCl 150 mM para o barril de referência do ISM. Armazene-o em uma seringa de 10 mL anexada a um filtro de 0,22 μm (para remover bactérias ou partículas).
2. Prepare uma solução de aterramento de cloreto de TMA 150 mM (TMA-Cl) par.......

A utilidade da técnica RTI é demonstrada em um experimento projetado para medir as mudanças em α e durante um desafio hipoosmolar ( Figura 8 e Figura 9 ). Já foi demonstrado que a redução da osmolaridade do ECS por lavagem na ACSF hipotônica produzirá uma diminuição em α e um aumento em λ ¹³ .

Nesta exper.......

Figura 10: Dados não ideais que demonstram problemas técnicos comuns. (A) Diagramas de problemas técnicos comuns com microeletrodos de iontoforese: Comparação da versão normal do TMA de um microeletrodo funcionamento iontoforese com três fontes demonstrando questões técnicas. [Ampliação alta, a1] A corrente em uma fonte iontoforética ideal é carregada igualmente pela liberação de TMA.......

O trabalho foi apoiado pelo NIH NINDS concessão R01 NS047557.