Iontoforesis en tiempo real con tetrametilamonio para cuantificar la fracción de volumen y la tortuosidad del espacio extracelular cerebral

Este protocolo describe la iontoforesis en tiempo real, un método que mide los parámetros físicos del espacio extracelular (ECS) de los cerebros vivos. La difusión de una molécula inerte liberada en el ECS se utiliza para calcular la fracción volumétrica de ECS y la tortuosidad. Es ideal para estudiar cambios reversibles agudos en ECS cerebral.

Esta revisión describe los conceptos básicos y el protocolo para realizar el método de iontoforesis en tiempo real (RTI), el patrón oro para explorar y cuantificar el espacio extracelular (ECS) del cerebro vivo. El ECS rodea todas las células cerebrales y contiene tanto el líquido intersticial como la matriz extracelular. El transporte de muchas sustancias necesarias para la actividad cerebral, incluyendo neurotransmisores, hormonas y nutrientes, se produce por difusión a través de la ECS. Los cambios en el volumen y la geometría de este espacio ocurren durante los procesos cerebrales normales, como el sueño, y condiciones patológicas, como la isquemia. Sin embargo, la estructura y la regulación de ECS cerebral, particularmente en estados enfermos, sigue siendo en gran parte inexplorada. El método RTI mide dos parámetros físicos del cerebro vivo: fracción volumétrica y tortuosidad. La fracción de volumen es la proporción de volumen de tejido ocupado por ECS. La tortuosidad es una medida del impedimento relativo que una sustancia encuentra cuando se difunde a través de un cerebroEn comparación con un medio sin obstrucciones. En RTI, una molécula inerte es pulsada desde un microelectrodo fuente en el cerebro ECS. A medida que las moléculas se difunden lejos de esta fuente, la concentración cambiante del ion se mide con el tiempo usando un microelectrodo selectivo de iones situado aproximadamente a 100 μm de distancia. A partir de la curva de difusión resultante, tanto la fracción volumétrica como la tortuosidad pueden ser calculadas. Esta técnica se ha utilizado en rebanadas cerebrales de múltiples especies (incluyendo seres humanos) e in vivo para estudiar los cambios agudos y crónicos de ECS. A diferencia de otros métodos, RTI se puede utilizar para examinar tanto los cambios reversibles e irreversibles de la ECS cerebral en tiempo real.

El espacio extracelular (ECS) es la red de canales interconectados exteriores a todas las células cerebrales y contiene tanto fluido intersticial como matriz extracelular ( Figura 1a y Figura 1b ). La distribución de muchas sustancias necesarias para la función de las células cerebrales, incluyendo nutrientes, hormonas y neurotransmisores, se produce por difusión a través de la ECS. Los cambios en los parámetros físicos de este espacio, incluyendo el volumen, la geometría y la matriz extracelular, pueden afectar drásticamente la difusión a través de la ECS y las concentraciones de iones locales que bañ....

Todos los procedimientos con animales, usados ​​para obtener muestras de tejido, fueron aprobados por el comité de ética animal en el SUNY Downstate Medical Center.

1. Preparación de soluciones y equipos

1. Preparar una solución de relleno de NaCl 150 mM para el barril de referencia del ISM. Guárdelo en una jeringa de 10 ml unida a un filtro de 0,22 μm (para eliminar bacterias o partículas).
2. Preparar una solución de relleno de cloruro TMA (TMA-Cl) 150 mM para lo.......

La utilidad de la técnica RTI se demuestra en un experimento diseñado para medir los cambios en α y durante un desafío hipoosmolar ( Figura 8 y Figura 9 ). Se ha demostrado previamente que la reducción de la osmolaridad de la ECS mediante lavado sobre ACSF hipotónico producirá una disminución en α y un aumento en λ ¹³ .

Figura 10: Datos no ideales que demuestran problemas técnicos comunes. (A) Los diagramas de problemas técnicos comunes con microelectrodos de iontoforesis: Comparación de la liberación normal de TMA de un microelectrodo funcionamiento iontoforesis con tres fuentes que demuestran problemas técnicos. [Aumento alto, a1] La corriente en una fuente iontoforética ideal es llevada igualmente por la .......

El trabajo fue apoyado por NIH NINDS concesión R01 NS047557.