Beyin Ekstraselüler Alanının Hacim Fraksiyonu ve Kıvrımını Nicelleştirmek için Tetrametilamonyum ile Gerçek Zamanlı İyontoforez

Bu protokol, canlı beyinlerin hücre dışı alanının (ECS) fiziksel parametrelerini ölçen bir yöntem olan gerçek zamanlı iyontoforez'i tanımlamaktadır. ECS hacim fraksiyonunu ve kıvırcıklığı hesaplamak için, ECS'ye salınan atıl bir molekülün difüzyonu kullanılır. Beyindeki ECS'de akut geri dönüşümlü değişikliklerin incelenmesi için idealdir.

Bu derlemede, yaşayan beynin hücre dışı alanını (ECS) araştırmak ve ölçmek için altın standart olan gerçek zamanlı iyontoforez (RTI) yöntemini gerçekleştirmek için temel kavramlar ve protokol açıklanmaktadır. ECS tüm beyin hücrelerini çevreler ve hem interstisyel sıvı hem de hücre dışı matris içerir. Nörotransmitterler, hormonlar ve besinler dahil olmak üzere beyin aktivitesi için gerekli olan birçok maddenin taşınması, ECS yoluyla difüzyon yoluyla gerçekleşir. Bu alanın hacmi ve geometrisindeki değişiklikler, uyku gibi normal beyin süreçleri ve iskemi gibi patolojik koşullar sırasında ortaya çıkar. Bununla birlikte, özellikle hastalıklı ülkelerdeki beyin ECS'sinin yapısı ve düzenlenmesi, büyük ölçüde keşfedilmemiş olarak kalmaktadır. RTI yöntemi canlı beyindeki iki fiziksel parametreyi ölçer: hacim fraksiyonu ve kıvırcıklık. Hacim fraksiyonu, ECS tarafından işgal edilen doku hacminin oranıdır. Kıvrımlanma, bir maddenin bir beyin yoluyla difüze ederken karşılaştığı göreli engelin bir ölçüsüdür.Engelsiz bir ortamla karşılaştırıldığında. RTI'de, atıl bir molekül, bir kaynak mikro elektrottan beyin ECS'ye palslanır. Moleküller bu kaynaktan uzaklaştıkça, iyonun değişen konsantrasyonu, yaklaşık olarak 100 um uzaklığa yerleştirilmiş bir iyon seçici mikroelektrod kullanarak zamana göre ölçülür. Elde edilen difüzyon eğrisinden hacim fraksiyonu ve kıvrımlılık hesaplanabilir. Bu teknik, birden fazla türün (insan dahil) beyin dilimlerinde ve in vivo olarak ECS'de akut ve kronik değişiklikler üzerinde çalışılmıştır. Diğer yöntemlerin aksine, RTI, gerçek zamanlı olarak beyindeki ECS'de geri döndürülebilir ve geri dönüşü olmayan değişiklikleri incelemek için kullanılabilir.

Ekstrasellüler boşluk (ECS), tüm beyin hücrelerinin dışındaki birbirine bağlı kanalların ağıdır ve hem interstisyel sıvı hem de hücre dışı matris içerir ( Şekil 1a ve Şekil 1b ). Besin maddeleri, hormonlar ve nörotransmitterler de dahil olmak üzere beyin hücresi fonksiyonu için gerekli birçok maddenin dağılımı ECS yoluyla difüzyon yoluyla gerçekleşir. Hacim, geometri ve hücre dışı matris de dahil olmak üzere bu alanın fiziksel parametrelerindeki değişiklikler, beyin hücresi fonksiyonu ^{1 , 2} üzerinde derin bir etkisi olan beyin hücrelerini içine....

Doku örnekleri almak için kullanılan tüm hayvan işlemleri, SUNY Downstate Tıp Merkezi'ndeki hayvan etiği komitesince onaylandı.

1. Çözümlerin ve Ekipmanların Hazırlanması

1. ISM referans varil için 150 mM NaCl dolgu çözeltisi hazırlayın. 0.22 μm'lik bir filtreye (bakteri veya partikülleri çıkarmak için) bağlı 10 mL şırınga içine saklayın.
2. Mikroelektrodlar için 150 mM TMA klorür (TMA-Cl) doldurma çözeltisi hazırlayın. 0.22 μm'.......

Rti tekniğin yardımcı a değişiklikleri ölçmek için tasarlanmış bir deneyde bir hypoosmolar cebine (Şekil 8 ve Şekil 9) sırasında gösterilmiştir. Daha önce, hipotonik ACSF ile yıkanarak ECS ozmolaritesini indirgeme a bir azalma ve A ¹³ bir artış üretecektir gösterilmiştir.

Bu deneyde, RTI her iki.......

Şekil 10: Ortak Teknik Konuları Gösteren İdeal Olmayan Veriler. ( A ) İyontoforez mikroelektrodlarıyla ortak teknik konuların diyagramları: Üç kaynaktan oluşan, teknik bir sorun gösteren, işleyen bir iyontoforez mikroelektrodunun TMA'nın normal salınımının karşılaştırılması. [Yüksek büyütme, a1] İdeal bir iyontoforetik kaynaktaki akım, TMA salınımı ve klorür al?.......

Çalışma, NIH NINDS hibe R01 NS047557 tarafından desteklendi.