来自新世界Zika病毒感染性克隆的重组病毒的救援和表征

该方案描述了从双质粒感染性cDNA克隆中恢复感染性Zika病毒。

传染性cDNA克隆允许病毒的遗传操作，从而有助于疫苗，发病机理，复制，传播和病毒进化的工作。在这里，我们描述了Zika病毒（ZIKV）感染性克隆的构建，目前在美洲引起爆发性爆发。为了防止黄病毒衍生质粒通常观察到的对细菌的毒性，我们产生了一个双质粒系统，其将NS1基因的基因组分离，并且比不能在没有突变的情况下成功恢复的全长构建体更稳定。在消化和连接两个片段后，可以通过T7 RNA聚合酶的体外转录产生全长病毒RNA。在将转录的RNA电穿孔进入细胞后，分别在小鼠和蚊子中显示类似的体外生长动力学和体内毒力和感染表型的病毒。

Zika病毒（ZIKV;家庭黄病毒科： 黄病毒属）是一种蚊子传播的黄病毒，于2013-14年抵达巴西，随后发生在美洲蔓延的发热性疾病的大规模爆发¹ 。此外，ZIKV已经与严重的疾病结果相关联，如成人的吉兰 - 巴雷综合征和胎儿和新生儿的小头症² 。在西半球迅速传播之前，关于ZIKV的知之甚少。这包括缺乏分子工具，从而阻碍机械研究。用于病毒的分子工具，例如感染性cDNA克隆，促进疫苗和抗病毒治疗发展，并允许评估与差异病毒发病机理，免疫应答和病毒进化相关的病毒遗传因素。

已知黄病毒感染性克隆由于cr而在细菌中高度不稳定其基因组中存在的原核启动子³ 。已经采用了几种方法来改善这个问题;包括在病毒序列上游插入串联重复⁴ ，推定的原核启动子序列的突变⁵ ，将基因组分裂成多个质粒⁶ ，低拷贝数载体（包括细菌人造染色体） ^7,8和内含子在病毒基因组⁹中的插入。 ZIKV已经描述了一个没有修改的全长系统;然而，该克隆似乎在细胞培养物和小鼠中减弱

传染性克隆质粒的转化和恢复

1. 使用商业转化方案（ 例如 ，NEB 5分钟转化协议）转化两种质粒（单独）并进行一些修改。两种质粒含有编码氨苄青霉素抗性的基因，因此使用氨苄青霉素或羧苄青霉素进行选择。碳青霉素是较为稳定的。
   1. 从-80°C冰箱中取出细胞（参见材料表），并在冰上解冻5-10分钟。在37℃下，预热溶血培养液（LB）（含有10g / L NaCl和25μg/ mL羧苄青霉.......

这里描述的方案允许恢复感染性克隆衍生的Zika病毒。与高度不稳定的全长版本（数据未显示）相比，操作双质粒感染性克隆系统在小心执行时是简单的。在消化和连接两个不同的片段后，使用T7聚合酶的体外转录产生加帽的RNA，然后将其电穿孔至Vero细胞（ 图1 ）。在使用RCA或maxiprep进行大规模DNA生产后，可以使用限制性消化作为代谢物监测正?.......

Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode.......

作者要感谢克里斯汀·布拉德·费贝尔曼，米拉娜·维塞利诺维奇和克劳迪娅·鲁克特（ClaudiaRückert）的帮助，以表征克隆衍生的病毒。这项工作部分得到NIH国家过敏和传染病研究所赠款AI114675（BJG）和AI067380（GDE）的支持。