Redning og karakterisering af rekombinant virus fra en ny verden Zika Virus infektiøs klon

Denne protokol beskriver genopretningen af ​​infektiøs Zika-virus fra en to-plasmid-infektiøs cDNA-klon.

Infektiøse cDNA kloner tillader genetisk manipulation af en virus, hvilket letter arbejdet med vacciner, patogenese, replikation, transmission og viral evolution. Her beskriver vi opførelsen af ​​en infektiøs klon for Zika virus (ZIKV), der i øjeblikket forårsager et eksplosivt udbrud i Amerika. For at forhindre toksicitet for bakterier, der almindeligvis observeres med flavivirus-afledte plasmider, genererede vi et to-plasmidsystem, som adskiller genomet ved NS1-genet og er mere stabilt end konstruktioner i fuld længde, som ikke kunne genoprettes uden mutationer. Efter fordøjelse og ligering for at slutte sig til de to fragmenter, kan viral RNA i fuld længde genereres ved in vitro transkription med T7 RNA polymerase. Efter elektroporation af transkriberet RNA i celler blev virus udvundet, der udviser lignende in vitro vækstkinetik og in vivo virulens- og infektionsfænotyper hos henholdsvis mus og myg.

Zika virus (ZIKV; Family Flaviviridae : Genus Flavivirus ) er et mygebårne flavivirus, der ankom til Brasilien i 2013-14 og blev efterfølgende forbundet med et massivt udbrud af feber sygdom, der spredte sig i hele Amerika ¹ . Derudover har ZIKV været forbundet med alvorlige sygdomsresultater, såsom Guillain-Barré-syndrom hos voksne og mikrocefalier hos fostre og nyfødte ² . Lidt var kendt om ZIKV før dets hurtige spredning i den vestlige halvkugle. Dette indbefattede mangel på molekylære værktøjer, hvilket forhindrer mekanistisk forskning. Molekylære værktøjer til virus, såsom infektiøse cDNA kloner, ....

1. Transformation og gendannelse af infektiøse klonplasmider

1. Transform begge plasmider (separat) ved hjælp af en kommerciel transformationsprotokol ( f.eks . NEB 5 minutters transformationsprotokol) med nogle ændringer. Begge plasmider indeholder et gen, som koder for ampicillinresistens, derfor anvend ampicillin eller carbenicillin til udvælgelse. Carbenicillin foretrækkes, da det er mere stabilt.
   1. Fjern celler (se materialetabel) fra -80 ° C fryser og optø på is i 5.......

Protokollen beskrevet her muliggør genvinding af infektiøs klonafledt Zika-virus. Manipulering af det to-plasmid-infektiøse klonsystem er ligetil, når det udføres forsigtigt i sammenligning med versioner af fuld længde, der er stærkt ustabile (data ikke vist). Efter fordøjelse og ligering af de to adskilte stykker fremstilles afkortet RNA ved anvendelse af in vitro- transkription med T7-polymerase, som derefter elektroporeres i Vero-celler ( figur 1<.......

Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode.......

Forfatterne vil gerne takke Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic og Claudia Rückert for deres hjælp til at karakterisere den klonafledte virus. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH under tilskud AI114675 (BJG) og AI067380 (GDE).