Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
Dit protocol beschrijft het herstel van infectief Zika-virus uit een infectieuze cDNA-kloon met twee plasmiden.
Infectieuze cDNA-klonen zorgen voor genetische manipulatie van een virus, waardoor werk wordt vergemakkelijkt bij vaccins, pathogenese, replicatie, transmissie en virale evolutie. Hier beschrijven we de constructie van een besmettelijke kloon voor Zika virus (ZIKV), die momenteel een explosief uitbraak in Amerika veroorzaakt. Om toxiciteit te voorkomen voor bacteriën die gewoonlijk worden waargenomen met flavivirus-afgeleide plasmiden, gaven we een tweedimplantsysteem op dat het genoom bij het NS1-gen scheidt en stabieler is dan volledige constructies die niet succesvol zouden kunnen worden hersteld zonder mutaties. Na spijsvertering en ligatie om de twee fragmenten aan te sluiten kan full-length virale RNA gegenereerd worden door in vitro transcriptie met T7 RNA polymerase. Na elektroporatie van getranscribeerde RNA in cellen werd virus hersteld die respectievelijk dezelfde in vitro groei kinetiek en in vivo virulentie en infectie fenotypen vertoonde in respectievelijk muizen en muggen.
Zika-virus (ZIKV; Family Flaviviridae : Genus Flavivirus ) is een muskietgedragen flavivirus die in 2013-14 in Brazilië is aangekomen en vervolgens geassocieerd werd met een massale uitbraak van febriele ziekte die zich verspreidde over heel Amerika 1 . Daarnaast is ZIKV verbonden met ernstige ziekte-uitkomsten, zoals Guillain-Barré syndroom bij volwassenen en microcefalie bij foetussen en neonaten 2 . Weinig was bekend over ZIKV voor zijn snelle verspreiding in het westelijk halfrond. Dit omvatte een gebrek aan moleculaire hulpmiddelen, waardoor mechanistisch onderzoek werd belemmerd. Moleculaire hulp....
1. Transformatie en herstel van infectieuze klonenplasmiden
Het hier beschreven protocol zorgt voor het herstel van infectieus kloon afgeleid Zika virus. Het manipuleren van het infectieuze kloonsysteem met twee plasmiden is rechtdoor wanneer het met zorg wordt uitgevoerd, in vergelijking met volledige lengteversies die zeer instabiel zijn (data niet getoond). Na spijsvertering en ligatie van de twee afzonderlijke stukken wordt afgedekt RNA geproduceerd onder toepassing van in vitro transcriptie met T7-polymerase, dat vervolgens in Vero-.......
Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode.......
De auteurs willen Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic en Claudia Rückert bedanken voor hun hulp bij het karakteriseren van het kloon afgeleide virus. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten, NIH onder subsidies AI114675 (BJG) en AI067380 (GDE).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
Carbenicillin, Disodium Salt | various | ||
Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20,000 units/ml |
NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20,000 units/ml |
ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/ml |
EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20,000 units/ml |
BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20,000 units/ml |
HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20,000 units/ml |
illustra TempliPhi 100 Amplification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/ml |
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10,000 units/ml |
T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | 400,000units/mL |
HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
ECM 630 High Throughput Electroporation System | BTX | 45-0423 | Other machines are acceptable. |
LB Broth with agar (Miller) | Sigma | L3147 | Can be homemade as well. |
Terrific Broth | Sigma | T0918 | Can be homemade as well. |
Petri Dish | Celltreat | 229693 | |
Culture Tubes | VWR International | 60818-576 | |
T75 flasks | Celltreat | 229340 | |
T182 flasks | Celltreat | 229350 | |
1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose | Corning | 10-017-CV | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
Tragacanth Powder | MP Bio | MP 104792 | |
Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
Ethanol Denatured | VWR International | BDH1156-1LP | |
6 well plate | Celltreat | 229106 | |
12 well plate | Celltreat | 229111 | |
Sequencing Oligos | IDT | see table 1 | |
Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | other methods are acceptable. |
Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher | Q32850 | other methods are acceptable. |
Qubit RNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32852 | other methods are acceptable. |
Class II Biosafety Cabinet | Varies | N/A | This is necessary for live-virus work. |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved