Le sauvetage et la caractérisation du virus recombinant à partir d'un nouveau clone infectieux du virus Zika du monde

Ce protocole décrit la récupération du virus Zika infectieux à partir d'un clone d'ADNc infectieux à deux plasmides.

Les clones d'ADNc infectieux permettent une manipulation génétique d'un virus, facilitant ainsi le travail sur les vaccins, la pathogenèse, la replication, la transmission et l'évolution virale. Nous décrivons ici la construction d'un clone infectieux pour le virus Zika (ZIKV), qui provoque actuellement une épidémie explosive dans les Amériques. Pour éviter toute toxicité pour les bactéries qui sont communément observées avec les plasmides dérivés du flavivirus, nous avons généré un système à deux plasmides qui sépare le génome du gène NS1 et est plus stable que les constructions complètes qui ne peuvent pas être récupérées avec succès sans mutations. Après la digestion et la ligature pour rejoindre les deux fragments, l'ARN viral complet peut être généré par une transcription in vitro avec de l'ARN polymérase T7. Après l'électroporation de l'ARN transcrit dans les cellules, le virus a été récupéré qui a montré une cinétique de croissance in vitro similaire et des phénotypes de virulence et d'infection in vivo chez les souris et les moustiques, respectivement.

Le virus Zika (ZIKV; Family Flaviviridae : Genre Flavivirus ) est un flavivirus transmis par des moustiques qui est arrivé au Brésil en 2013-14 et a ensuite été associé à une épidémie massive de maladie fébrile qui s'est répandue dans les Amériques ¹ . En outre, le ZIKV a été lié à des résultats sévères liés à la maladie, tels que le syndrome de Guillain-Barré chez les adultes et la microcéphalie chez les fœtus et les nouveau-nés ² . On savait peu à propos de ZIKV avant sa propagation rapide dans l'hémisphère occidental. Cela comprenait un manque d'outils moléculaires, entravant ainsi la re....

1. Transformer et récupérer des plasmides de clones infectieux

1. Transformez les deux plasmides (séparément) en utilisant un protocole de transformation commercial ( p. Ex . NEB 5 Minute Transformation Protocol) avec quelques modifications. Les deux plasmides contiennent un gène codant pour la résistance à l'ampicilline, utilisent donc l'ampicilline ou la carbénicilline pour la sélection. La carbénicilline est préférée, car elle est plus stable.
   1. Enlevez le.......

Le protocole décrit ici permet la récupération du virus infectieux dérivé du clone Zika. La manipulation du système de clones infectieux à deux plasmides est simple lorsqu'ils sont exécutés avec précaution, par rapport aux versions intégrales très instables (données non représentées). Après la digestion et la ligature des deux pièces distinctes, l'ARN coiffé est produit en utilisant une transcription in vitro avec une polymerase T7 qui est ensu.......

Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode.......

Les auteurs souhaitent remercier Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic et Claudia Rückert pour leur aide dans la caractérisation du virus dérivé du clone. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de l'Institut national d'allergie et de maladies infectieuses, NIH sous les subventions AI114675 (BJG) et AI067380 (GDE).