Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
Rettung und Charakterisierung des rekombinanten Virus aus einer neuen Welt Zika Virus Infectious Clone
Dieses Protokoll beschreibt die Wiederherstellung des infektiösen Zika-Virus aus einem zwei-Plasmid-infektiösen cDNA-Klon.
Infektiöse cDNA-Klone erlauben die genetische Manipulation eines Virus und erleichtern so die Arbeit an Impfstoffen, Pathogenese, Replikation, Übertragung und Virusentwicklung. Hier beschreiben wir den Aufbau eines infektiösen Klons für Zika Virus (ZIKV), der derzeit einen explosiven Ausbruch in Nord- und Südamerika verursacht. Um Toxizität gegenüber Bakterien zu verhindern, die häufig mit Flavivirus-abgeleiteten Plasmiden beobachtet wird, erzeugten wir ein Zwei-Plasmid-System, das das Genom am NS1-Gen trennt und stabiler ist als Volllängen-Konstrukte, die ohne Mutationen nicht erfolgreich gewonnen werden konnten. Nach der Verdauung und Ligation, um die beiden Fragmente zu verbinden, kann eine Volllängen-Virus-RNA durch in vitro- Transkription mit T7-RNA-Polymerase erzeugt werden. Nach der Elektroporation von transkribierter RNA in Zellen wurde das Virus gewonnen, das ähnliche In-vitro- Wachstumskinetiken und In-vivo- Virulenz- und Infektions-Phänotypen in Mäusen und Mücken zeigte.
Zika-Virus (ZIKV, Familie Flaviviridae : Gattung Flavivirus ) ist ein Moskito-getragenes Flavivirus, das in Brasilien in den Jahren 2013-14 angekommen ist und anschließend mit einem massiven Ausbruch der fiebrigen Krankheit verbunden war, die sich in ganz Amerika verbreitete 1 . Darüber hinaus wurde ZIKV mit schwerwiegenden Erkrankungen wie dem Guillain-Barré-Syndrom bei Erwachsenen und Mikrozephalie bei Föten und Neugeborenen verknüpft 2 . Wenig war über ZIKV vor seiner schnellen Verbreitung in der westlichen Hemisphäre bekannt. Dazu gehört ein Mangel an molekularen Werkzeugen, was die mechanistische ....
1. Transformation und Wiederherstellung von infektiösen Klonplasmiden
- Transformieren Sie beide Plasmide (getrennt) unter Verwendung eines kommerziellen Transformationsprotokolls ( z. B. NEB 5 Minute Transformation Protocol) mit einigen Modifikationen. Beide Plasmide enthalten ein für die Ampicillinresistenz kodierendes Gen, daher verwenden sie Ampicillin oder Carbenicillin zur Selektion. Carbenicillin wird bevorzugt, da es stabiler ist.
- Entfernen Sie die Zellen (siehe Mate.......
Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Wiederherstellung von infektiösem Klon-abgeleiteten Zika-Virus. Das Manipulieren des Zwei-Plasmid-Infektios-Klonsystems ist einfach, wenn es mit Sorgfalt durchgeführt wird, im Vergleich zu Volllängen-Versionen, die sehr instabil sind (Daten nicht gezeigt). Nach der Verdauung und Ligation der beiden verschiedenen Stücke wird eine Capped-RNA unter Verwendung einer in vitro- Transkription mit T7-Polymerase hergestellt, die dann in.......
Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode.......
Die Autoren danken Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic und Claudia Rückert für ihre Unterstützung bei der Charakterisierung des vom Klon abgeleiteten Virus. Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse des Nationalen Instituts für Allergie und Infektionskrankheiten, NIH unter den Stipendien AI114675 (BJG) und AI067380 (GDE) unterstützt.
....| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
| Carbenicillin, Disodium Salt | various | ||
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
| ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
| SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20,000 units/ml |
| NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20,000 units/ml |
| ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/ml |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20,000 units/ml |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20,000 units/ml |
| HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20,000 units/ml |
| illustra TempliPhi 100 Amplification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/ml |
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10,000 units/ml |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | 400,000units/mL |
| HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| ECM 630 High Throughput Electroporation System | BTX | 45-0423 | Other machines are acceptable. |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma | L3147 | Can be homemade as well. |
| Terrific Broth | Sigma | T0918 | Can be homemade as well. |
| Petri Dish | Celltreat | 229693 | |
| Culture Tubes | VWR International | 60818-576 | |
| T75 flasks | Celltreat | 229340 | |
| T182 flasks | Celltreat | 229350 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| Tragacanth Powder | MP Bio | MP 104792 | |
| Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
| Ethanol Denatured | VWR International | BDH1156-1LP | |
| 6 well plate | Celltreat | 229106 | |
| 12 well plate | Celltreat | 229111 | |
| Sequencing Oligos | IDT | see table 1 | |
| Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | other methods are acceptable. |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher | Q32850 | other methods are acceptable. |
| Qubit RNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32852 | other methods are acceptable. |
| Class II Biosafety Cabinet | Varies | N/A | This is necessary for live-virus work. |
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