Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
פרוטוקול זה מתאר את ההתאוששות של וירוס זיהום זיהומיות משני שיבוט cDNA שני פלסמיד זיהומיות.
שיבוטים cDNA זיהומיות לאפשר מניפולציה גנטית של הנגיף, ובכך להקל על עבודה על חיסונים, פתוגנזה, שכפול, שידור האבולוציה ויראלי. כאן אנו מתארים את הבנייה של שיבוט זיהומיות עבור Zika וירוס (ZIKV), אשר כרגע גורם להתפרצות נפץ באמריקה. כדי למנוע רעילות לחיידקים, כי הוא נצפה בדרך כלל עם פלסמידים הנגזרים flavivirus, יצרנו מערכת שני פלסמיד המפריד בין הגנום בגן NS1 והוא יציב יותר מאשר באורך מלא בונה שלא ניתן לשחזר בהצלחה ללא מוטציות. לאחר עיכול קשירת להצטרף שני קטעים, RNA ויראלי באורך מלא יכול להיווצר על ידי שעתוק במבחנה עם פולימרז T7 RNA. בעקבות electroporation של RNA transcribed לתאים, וירוס היה התאושש כי הציג דומה קינטיקה הצמיחה במבחנה ב vivo ארסיות פנוטיפים זיהום בעכברים ויתושים, בהתאמה.
נגיף זיקה (ZIKV: משפחה Flaviviridae : Genus Flavivirus ) הוא flavivirus שנולדו יתוש שהגיע בברזיל ב 2013-14 ו היה קשור לאחר מכן עם התפרצות מסיבית של מחלה חום כי התפשטה ברחבי אמריקה 1 . בנוסף, ZIKV נקשר לתוצאות חמורות של המחלה, כגון תסמונת Guillain-Barré במבוגרים ו מיקרוסקפליה בעוברים ובילודים. מעט ידוע על ZIKV לפני התפשטותה המהירה בחצי הכדור המערבי. זה כלל היעדר כלים מולקולריים, ובכך מעכב מחקר מכניסטי. כלים מולקולריים לווירוסים, כגון שיבוטים cDNA זיהומיות, להקל על החיסון ועל התפתחות טיפולית אנטי ויראלית, ולאפשר הערכה של גורמים גנטיים ויראליים הקשורים פתוגנזה ויראלי דיפרנציאלי, ה....
1. המרה ושחזור של פלסמידים משוכפלים זיהומיות
פרוטוקול המתואר כאן מאפשר התאוששות של זיהום נגוע נגוע זיקה וירוס. מניפולציה של שני מערכת פלסמיד שיבוט זיהומיות היא פשוטה כאשר מבוצעת בזהירות, לעומת גירסאות באורך מלא, שהם מאוד לא יציבים (נתונים לא מוצגים). לאחר עיכול קשירת של שתי חתיכות נפרדות, כתרים.......
Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode.......
המחברים מבקשים להודות לקריסטן בולרד-פייבלמן, למילנה וסלינוביץ וקלאודיה רוקר על עזרתם באפיון הווירוס הנגזר משבטים. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקים של המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, NIH תחת מענקים AI114675 (BJG) ו AI067380 (GDE).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
Carbenicillin, Disodium Salt | various | ||
Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20,000 units/ml |
NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20,000 units/ml |
ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/ml |
EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20,000 units/ml |
BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20,000 units/ml |
HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20,000 units/ml |
illustra TempliPhi 100 Amplification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/ml |
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10,000 units/ml |
T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | 400,000units/mL |
HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
ECM 630 High Throughput Electroporation System | BTX | 45-0423 | Other machines are acceptable. |
LB Broth with agar (Miller) | Sigma | L3147 | Can be homemade as well. |
Terrific Broth | Sigma | T0918 | Can be homemade as well. |
Petri Dish | Celltreat | 229693 | |
Culture Tubes | VWR International | 60818-576 | |
T75 flasks | Celltreat | 229340 | |
T182 flasks | Celltreat | 229350 | |
1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose | Corning | 10-017-CV | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
Tragacanth Powder | MP Bio | MP 104792 | |
Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
Ethanol Denatured | VWR International | BDH1156-1LP | |
6 well plate | Celltreat | 229106 | |
12 well plate | Celltreat | 229111 | |
Sequencing Oligos | IDT | see table 1 | |
Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | other methods are acceptable. |
Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher | Q32850 | other methods are acceptable. |
Qubit RNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32852 | other methods are acceptable. |
Class II Biosafety Cabinet | Varies | N/A | This is necessary for live-virus work. |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved