Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
यह प्रोटोकॉल संक्रामक Zika वायरस की दो-प्लाज्मिड संक्रामक सीडीएनए क्लोन से पुनर्प्राप्ति का वर्णन करता है।
संक्रामक सीडीएनए क्लोन वायरस के आनुवंशिक हेरफेर के लिए अनुमति देते हैं, इस प्रकार टीके, रोगजनन, प्रतिकृति, संचरण और वायरल विकास पर काम करने में मदद करते हैं। यहां हम ज़िका वायरस (जेडआईकेवी) के लिए संक्रामक क्लोन के निर्माण का वर्णन करते हैं, जो वर्तमान में अमेरिका में एक विस्फोटक प्रकोप पैदा कर रहा है। आमतौर पर फ्लैविवायरस-व्युत्पन्न प्लास्मिड के साथ जीवाणुओं को विषाक्तता को रोकने के लिए, हमने एक दो-प्लाज्मिड प्रणाली उत्पन्न की जो एनएस 1 जीन में जीनोम को अलग करती है और पूर्ण-लंबाई वाले निर्माणों से अधिक स्थिर होती है, जो उत्परिवर्तनों के बिना सफलतापूर्वक पुनर्प्राप्त नहीं की जा सकती। दो टुकड़ों में शामिल होने के लिए पाचन और बंधन के बाद, पूर्ण लंबाई वाले वायरल आरएनए इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा टी 7 आरएनए पोलीमरेज़ के साथ उत्पन्न हो सकता है। कोशिकाओं में लिखित आरएनए के इलेक्ट्रोप्लोरेशन के बाद, वायरस को वसूला गया था जो कि इन विट्रो विकास कैनेटीक्स में और विवो विषाक्तता और चूहों और मच्छरों में संक्रमण के phenotypes में क्रमशः प्रदर्शित किया गया था।
ज़िका वायरस (जीआईआईकेवी; फ़ैमिली फ्लैविविरिडे : जीनस फ्लैवियरस ) एक मच्छर से पैदा हुआ फ्लैवियर है जो 2013-14 में ब्राजील पहुंचा था और बाद में अमेरिका के 1 में फैल जाने वाली बुखार की बीमारी के बड़े पैमाने पर फैलने से जुड़ा था। इसके अलावा, ZIKV गंभीर रोग परिणामों से जुड़ा हुआ है, जैसे कि वयस्कों में गिलेन-बैर सिंड्रोम और भ्रूणों और नवजात 2 में माइक्रोसेफली। पश्चिमी गोलार्ध में तेज़ी से फैल जाने से पहले ज़िंक के बारे में बहुत कुछ जाना जाता था। इसमें आणविक टूल की कमी शामिल है, इस प्रकार तंत्रिकी अनुसंधान में बाधा है। वायरस के लिए आणविक उपकरण, जैसे संक्रामक सीडीएनए क्लोन, वैक्सीन और एंटीवायरल चिकित्सीय विका....
Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode.......
क्लोन व्युत्पन्न वायरस को दर्शाने में उनकी सहायता के लिए लेखक क्रिस्टन बलार्ड-फेबेलमेन, मिलिना वेसेलिनोविक और क्लाउडिया रुक्कर्ट का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। एनआईएच अनुदान के तहत AI114675 (बीजीजी) और एआईटी 67380 (जीडीई) के राष्ट्रीय अनुदान संस्थान, एलआईजी और संक्रामक रोगों से अनुदान के द्वारा इस काम का समर्थन किया गया था।
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
Carbenicillin, Disodium Salt | various | ||
Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20,000 units/ml |
NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20,000 units/ml |
ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/ml |
EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20,000 units/ml |
BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20,000 units/ml |
HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20,000 units/ml |
illustra TempliPhi 100 Amplification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/ml |
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10,000 units/ml |
T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | 400,000units/mL |
HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
ECM 630 High Throughput Electroporation System | BTX | 45-0423 | Other machines are acceptable. |
LB Broth with agar (Miller) | Sigma | L3147 | Can be homemade as well. |
Terrific Broth | Sigma | T0918 | Can be homemade as well. |
Petri Dish | Celltreat | 229693 | |
Culture Tubes | VWR International | 60818-576 | |
T75 flasks | Celltreat | 229340 | |
T182 flasks | Celltreat | 229350 | |
1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose | Corning | 10-017-CV | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
Tragacanth Powder | MP Bio | MP 104792 | |
Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
Ethanol Denatured | VWR International | BDH1156-1LP | |
6 well plate | Celltreat | 229106 | |
12 well plate | Celltreat | 229111 | |
Sequencing Oligos | IDT | see table 1 | |
Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | other methods are acceptable. |
Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher | Q32850 | other methods are acceptable. |
Qubit RNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32852 | other methods are acceptable. |
Class II Biosafety Cabinet | Varies | N/A | This is necessary for live-virus work. |
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