Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
새로운 세계 Zika 바이러스 전염성 클론으로부터 재조합 바이러스의 구조 및 특성 규명
이 프로토콜은 두 개의 플라스미드 감염성 cDNA 클론으로부터 감염성 Zika 바이러스의 회수를 설명합니다.
전염성 cDNA 클론은 바이러스의 유전자 조작을 허용하여 백신, 병인 발생, 복제, 전달 및 바이러스 진화에 대한 작업을 용이하게합니다. 여기에서는 Zika 바이러스 (ZIKV)에 대한 전염성 클론의 구축에 대해 설명합니다. ZIKV는 현재 미국에서 폭발적인 발병을 일으키고 있습니다. 플라 비 바이러스 유래 플라스미드에서 흔히 볼 수있는 박테리아에 대한 독성을 막기 위해 우리는 NS1 유전자에서 게놈을 분리하는 2 플라스미드 시스템을 만들었으며 돌연변이없이 성공적으로 복구 할 수 없었던 완전한 길이의 구조물보다 더 안정적이었다. 두 조각을 연결하기위한 소화 및 결합 후, 전장 바이러스 RNA는 T7 RNA 폴리머 라제로 시험 관내 전사에 의해 생성 될 수있다. 전사 된 RNA가 세포 내로 전기 천공 된 후 바이러스와 유사한 생체 내 성장 동역학 및 생체 내 독성 및 감염 표현형이 마우스 및 모기에서 각각 나타났다.
Zika 바이러스 (ZIKV, Family Flaviviridae : Flavivirus 속)는 2013-14 년 브라질에 도착한 모기에 의한 플라 비 바이러스로 이후 미주 전역에 퍼져 있던 열병의 대규모 발생과 관련이 있습니다 1 . 또한, ZIKV는 성인의 길랑 발레 증후군 및 태아 및 신생아의 소두증과 같은 심각한 질병 결과와 관련되어 있습니다 2 . 서반구에서 급속하게 확산되기 전에 ZIKV에 대해 알려진 것이 거의 없다. 여기에는 분자 도구가 없어 기계 론적 연구가 어려웠습니다. 감염성 cDNA 클론과 같은 바이러스의 분자 도구는 백신 및 항 바이러스 치료 개발을 촉진하고 차별적 인 바이러스 병인, 면역 반응 및 바이러스 성 진화와 관련된 바이러스 유전 인자의 평가를 허용합니다.
플라 비 바이러스 전염성 클론은 cr 때문에 박테리아에서 매우 불안정한 것으로 알려져있다그들의 게놈에 존재하는 유익한 원핵 생물 프로모터 3 . 이 문제를 개선하기 위해 몇 가지 접근법이 사용되었습니다. 바이러스 서열 4의 상류 중계 반복의 삽입, 추정 ....
1. 감염성 클론 Plasmid의 형질 전환 및 회수
- 상업적 형질 전환 프로토콜 ( 예 : NEB 5 Minute Transformation Protocol)을 사용하여 두 가지 플라스미드 (일부분)를 변형하여 변형시킨다. 두 플라스미드 모두 암피실린 내성을 나타내는 유전자를 포함하고 있으므로 선택시 암피실린이나 카 베니 실린을 사용하십시오. Carbenicillin은보다 안정적이므로 선호됩니다.
- -80 ° C의 냉동고.......
여기에 설명 된 프로토콜은 전염성 클론 파생 Zika 바이러스의 복구를 허용합니다. 2 플라스미드 감염 복제 시스템을 조작하는 것은 매우 불안정한 전장 버전 (데이터는 표시되지 않음)과 비교하여 신중하게 수행하면 간단합니다. 두 개의 개별 조각의 소화 및 연결 후, 봉쇄 된 RNA는 Vero 세포 ( 그림 1 )로 electroporated 다음 T7 중합 효소와 시험 관내
Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode.......
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
| Carbenicillin, Disodium Salt | various | ||
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
| ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
| SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20,000 units/ml |
| NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20,000 units/ml |
| ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/ml |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20,000 units/ml |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20,000 units/ml |
| HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20,000 units/ml |
| illustra TempliPhi 100 Amplification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/ml |
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10,000 units/ml |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | 400,000units/mL |
| HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| ECM 630 High Throughput Electroporation System | BTX | 45-0423 | Other machines are acceptable. |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma | L3147 | Can be homemade as well. |
| Terrific Broth | Sigma | T0918 | Can be homemade as well. |
| Petri Dish | Celltreat | 229693 | |
| Culture Tubes | VWR International | 60818-576 | |
| T75 flasks | Celltreat | 229340 | |
| T182 flasks | Celltreat | 229350 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| Tragacanth Powder | MP Bio | MP 104792 | |
| Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
| Ethanol Denatured | VWR International | BDH1156-1LP | |
| 6 well plate | Celltreat | 229106 | |
| 12 well plate | Celltreat | 229111 | |
| Sequencing Oligos | IDT | see table 1 | |
| Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | other methods are acceptable. |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher | Q32850 | other methods are acceptable. |
| Qubit RNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32852 | other methods are acceptable. |
| Class II Biosafety Cabinet | Varies | N/A | This is necessary for live-virus work. |
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