Redning og karakterisering av rekombinant virus fra en ny verden Zika Virus smittsom klon

Denne protokollen beskriver utvinningen av smittsomt Zika-virus fra en to-plasmidinfeksjonell cDNA-klon.

Infeksiøse cDNA kloner tillater genetisk manipulering av et virus, og dermed letter arbeidet med vaksiner, patogenese, replikasjon, overføring og viral evolusjon. Her beskriver vi konstruksjonen av en smittsom klon for Zika virus (ZIKV), som for tiden forårsaker et eksplosivt utbrudd i Amerika. For å forhindre toksisitet for bakterier som vanligvis observeres med flavivirus-avledede plasmider, genererte vi et to-plasmidsystem som separerer genomet ved NS1-genet og er stabile enn full lengdekonstruksjoner som ikke kunne bli vellykket gjenopprettet uten mutasjoner. Etter fordøyelse og ligering for å bli med i de to fragmentene, kan full lengde viralt RNA genereres ved in vitro transkripsjon med T7 RNA polymerase. Etter elektroporering av transkribert RNA i celler ble virus gjenvunnet som utviste tilsvarende in vitro vekstkinetikk og in vivo virulens- og infeksjonsfenotyper hos henholdsvis mus og mygg.

Zika-virus (ZIKV; Family Flaviviridae : Genus Flavivirus ) er et mygg-båret flavivirus som kom til Brasil i 2013-14 og ble senere assosiert med et massivt utbrudd av feber sykdom som spredte seg over hele Amerika ¹ . I tillegg har ZIKV vært knyttet til alvorlige sykdomsutfall, slik som Guillain-Barré syndrom hos voksne og mikrocefali hos foster og nyfødte ² . Det var lite kjent om ZIKV før den raske spredningen i den vestlige halvkule. Dette innebar mangel på molekylære verktøy, og dermed hindret mekanistisk forskning. Molekylære verktøy for virus, som infeksiøse cDNA kloner, lette vaksine og antiviral....

1. Transformasjon og gjenvinning av smittsomme klonplasmider

1. Transform begge plasmidene (separat) ved hjelp av en kommersiell transformasjonsprotokoll ( f.eks . NEB 5 Minute Transformation Protocol) med noen modifikasjoner. Begge plasmidene inneholder et gen som koder for ampicillinresistens, derfor bruk ampicillin eller carbenicillin for seleksjon. Carbenicillin er foretrukket, da det er mer stabilt.
   1. Fjern celler (se materialetabell) fra -80 ° C fryser og tine på is i 5-1.......

Protokollen beskrevet her muliggjør utvinning av infeksiøst klonavledet Zika-virus. Manipulering av det to-plasmidinfeksjonelle klonsystemet er rettferdig når det utføres med forsiktighet, sammenlignet med full lengdeversjoner som er svært ustabile (data ikke vist). Etter fordøyelse og ligering av de to adskilte stykkene, blir takket RNA fremstilt ved bruk av in vitro transkripsjon med T7-polymerase, som deretter elektroporeres i Vero-celler ( Figur 1<.......

Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode.......

Forfatterne vil gjerne takke Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic og Claudia Rückert for deres hjelp til å karakterisere klonavledet virus. Dette arbeidet ble delvis støttet av stipend fra National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH under tilskudd AI114675 (BJG) og AI067380 (GDE).