Salvamento e Caracterização do Vírus Recombinante de um Clone Infeccioso do Vírus do Novo Mundo Zika

Este protocolo descreve a recuperação do vírus Zika infeccioso a partir de um clone de cDNA infeccioso com dois plasmídeos.

Os clones de cDNA infecciosos permitem a manipulação genética de um vírus, facilitando assim o trabalho em vacinas, patogênese, replicação, transmissão e evolução viral. Aqui descrevemos a construção de um clone infeccioso para o vírus Zika (ZIKV), que atualmente está causando um surto explosivo nas Américas. Para evitar a toxicidade para bactérias comumente observadas com plasmídeos derivados de flavivírus, geramos um sistema de dois plasmídeos que separa o genoma no gene NS1 e é mais estável que as construções de comprimento total que não puderam ser recuperadas com sucesso sem mutações. Após a digestão e a ligação para unir os dois fragmentos, o ARN viral completo pode ser gerado por transcrição in vitro com polimerase de ARN T7. Após a eletroporação do ARN transcrito nas células, recuperou-se o vírus que apresentava cinética de crescimento in vitro semelhante e fenótipos de virulência e infecção in vivo em camundongos e mosquitos, respectivamente.

O vírus Zika (ZIKV; Família Flaviviridae : Gênero Flavivírus ) é um flavivírus transmitido por mosquito que chegou ao Brasil em 2013-14 e posteriormente foi associado a um surto maciço de doença febril que se espalhou pelas Américas ¹ . Além disso, o ZIKV tem sido associado a desfechos graves da doença, como a síndrome de Guillain-Barré em adultos e microcefalia em fetos e neonatos ² . Pouco se sabia sobre ZIKV antes da sua rápida propagação no hemisfério ocidental. Isso incluiu a falta de ferramentas moleculares, dificultando assim a pesquisa mecanicista. Ferramentas moleculares para vírus, t....

1. Transformação e Recuperação de Plasmídeos de Clone Infecciosos

1. Transforme ambos os plasmídeos (separadamente) usando um protocolo de transformação comercial ( por exemplo , NEB 5 Minute Transformation Protocol) com algumas modificações. Ambos os plasmídeos contêm um gene que codifica a resistência à ampicilina, portanto, use ampicilina ou carbenicilina para seleção. A carbanilhilina é preferida, pois é mais estável.
   1. Remova as células (veja a Tabela de .......

O protocolo aqui descrito permite a recuperação do vírus Zika infeccioso derivado de clones. Manipular o sistema de clones infecciosos de dois plasmídeos é direto quando realizado com cuidado, em comparação com versões completas que são altamente instáveis ​​(dados não mostrados). Após a digestão e a ligação das duas peças distintas, o ARN tampado é produzido usando transcrição in vitro com polimerase T7 que é então eletroporada em células Vero (

Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode.......

Os autores agradecem a Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic e Claudia Rückert por sua assistência na caracterização do vírus derivado de clones. Este trabalho foi apoiado em parte por doações do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, NIH sob subsídios AI114675 (BJG) e AI067380 (GDE).