Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
Спасение и характеристика рекомбинантного вируса из нового мира Инфекционный клон вируса Зика
Этот протокол описывает восстановление инфекционного вируса Зики из двух плазмидного инфекционного кДНК-клона.
Инфекционные кДНК-клоны позволяют генетически модифицировать вирус, тем самым облегчая работу с вакцинами, патогенезом, репликацией, передачей и развитием вируса. Здесь мы описываем создание инфекционного клона для вируса Зика (ZIKV), который в настоящее время вызывает взрывную вспышку в Северной и Южной Америке. Чтобы предотвратить токсичность бактерий, которые обычно наблюдаются с помощью плазмид, полученных из флавивируса, мы создали двухплазмидную систему, которая разделяет геном у NS1-гена и более стабильна, чем полноразмерные конструкции, которые не могут быть успешно восстановлены без мутаций. После переваривания и лигирования для соединения двух фрагментов полноразмерная вирусная РНК может быть получена транскрипцией in vitro с помощью РНК-полимеразы Т7. После электропорации транскрибируемой РНК в клетки был выделен вирус, который проявлял сходную кинетику роста in vitro и вирулентность и инфекционные фенотипы in vivo у мышей и москитов соответственно.
Вирус Zika (ZIKV; Family Flaviviridae : Genus Flavivirus ) - это флавивирус вируса комаров, который прибыл в Бразилию в 2013-14 годах и впоследствии был связан с массовой вспышкой фебрильной болезни, которая распространилась по всей Америке 1 . Кроме того, ZIKV был связан с тяжелыми последствиями заболевания, такими как синдром Гийена-Барре у взрослых и микроцефалия у плодов и новорожденных 2 . Мало что известно о ZIKV до его быстрого распространения в западном полушарии. Это включало отсутствие молекулярных инструментов, что препятствовало механистическим исследованиям. Молекулярные инструменты для ви....
1. Трансформирование и восстановление плазмид инфекционных клонов
- Преобразуйте обе плазмиды (отдельно) с использованием коммерческого протокола преобразования ( например , протокола NEB 5 Minute Transformation Protocol) с некоторыми изменениями. Обе плазмиды содержат ген, кодирующий у?.......
Протокол, описанный здесь, позволяет восстанавливать вирус Zika, зараженный вирусом. Манипулирование системой двух плазмид-инфекционных клонов является простым, когда выполняется с осторожностью, по сравнению с полноразмерными версиями, которые очень нестабильны (да?.......
Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode.......
Авторы хотели бы поблагодарить Кристен Буллард-Фейбельман, Милену Веселинович и Клаудию Рюкерт за помощь в описании вируса, полученного клонированием. Эта работа была частично поддержана грантами Национального института аллергии и инфекционных болезней NIH по грантам AI114675 (BJG) и AI067380 (GDE).
....| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
| Carbenicillin, Disodium Salt | various | ||
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
| ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
| SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20,000 units/ml |
| NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20,000 units/ml |
| ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/ml |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20,000 units/ml |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20,000 units/ml |
| HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20,000 units/ml |
| illustra TempliPhi 100 Amplification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/ml |
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10,000 units/ml |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | 400,000units/mL |
| HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| ECM 630 High Throughput Electroporation System | BTX | 45-0423 | Other machines are acceptable. |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma | L3147 | Can be homemade as well. |
| Terrific Broth | Sigma | T0918 | Can be homemade as well. |
| Petri Dish | Celltreat | 229693 | |
| Culture Tubes | VWR International | 60818-576 | |
| T75 flasks | Celltreat | 229340 | |
| T182 flasks | Celltreat | 229350 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| Tragacanth Powder | MP Bio | MP 104792 | |
| Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
| Ethanol Denatured | VWR International | BDH1156-1LP | |
| 6 well plate | Celltreat | 229106 | |
| 12 well plate | Celltreat | 229111 | |
| Sequencing Oligos | IDT | see table 1 | |
| Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | other methods are acceptable. |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher | Q32850 | other methods are acceptable. |
| Qubit RNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32852 | other methods are acceptable. |
| Class II Biosafety Cabinet | Varies | N/A | This is necessary for live-virus work. |
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveill. 19 (9), (2014).
- Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5' end of dengue virus RNA genome. PLoS One. 6 (3), e18197 (2011).
- Pu, S. Y., et al. A novel approach to propagate flavivirus infectious cDNA clones in bacteria by introducing tandem repeat sequences upstream of virus genome. J Gen Virol. 95 (Pt 7), 1493-1503 (2014).
- Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).
- Rice, C. M., Grakoui, A., Galler, R., Chambers, T. J. Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation. New Biol. 1 (3), 285-296 (1989).
- Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus. J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).
- Gualano, R. C., Pryor, M. J., Cauchi, M. R., Wright, P. J., Davidson, A. D. Identification of a major determinant of mouse neurovirulence of dengue virus type 2 using stably cloned genomic-length cDNA. J Gen Virol. 79 (Pt 3), 437-446 (1998).
- Johansen, I. E. Intron insertion facilitates amplification of cloned virus cDNA in Escherichia coli while biological activity is reestablished after transcription in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (22), 12400-12405 (1996).
- Shan, C., et al. An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence, Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors. Cell Host Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).
- Schwarz, M. C., et al. Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone. mSphere. 1 (5), (2016).
- Tsetsarkin, K. A., et al. A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development. MBio. 7 (4), (2016).
- Gadea, G., et al. A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene. Virology. 497, 157-162 (2016).
- Kapoor, M., Zhang, L., Mohan, P. M., Padmanabhan, R. Synthesis and characterization of an infectious dengue virus type-2 RNA genome (New Guinea C strain). Gene. 162 (2), 175-180 (1995).
- Messer, W. B., et al. Development and characterization of a reverse genetic system for studying dengue virus serotype 3 strain variation and neutralization. PLoS Negl Trop Dis. 6 (2), e1486 (2012).
- Kinney, R. M., et al. Avian virulence and thermostable replication of the North American strain of West Nile virus. J Gen Virol. 87 (Pt 12), 3611-3622 (2006).
- Chang, A. C., Cohen, S. N. Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid. J Bacteriol. 134 (3), 1141-1156 (1978).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. J Virol. 91 (1), (2017).
- Roberts, P. L., Lloyd, D. Virus inactivation by protein denaturants used in affinity chromatography. Biologicals. 35 (4), 343-347 (2007).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. (93), e52065 (2014).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. J Virol. , (2016).
- Grubaugh, N. D., et al. Genetic Drift during Systemic Arbovirus Infection of Mosquito Vectors Leads to Decreased Relative Fitness during Host Switching. Cell Host Microbe. 19 (4), 481-492 (2016).
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved