Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
Rescate y Caracterización del Virus Recombinante de un Nuevo Mundo Zika Virus Infectious Clone
Este protocolo describe la recuperación del virus Zika infeccioso a partir de un clon de ADNc infeccioso de dos plásmidos.
Los clones de cDNA infecciosos permiten la manipulación genética de un virus, facilitando así el trabajo sobre vacunas, patogénesis, replicación, transmisión y evolución viral. Aquí se describe la construcción de un clon infeccioso para el virus Zika (ZIKV), que actualmente está causando un brote explosivo en las Américas. Para evitar la toxicidad a las bacterias que se observa comúnmente con los plásmidos derivados de flavivirus, se generó un sistema de dos plásmidos que separa el genoma en el gen NS1 y es más estable que las construcciones de longitud completa que no pudo ser recuperado con éxito sin mutaciones. Después de la digestión y la ligación para unir los dos fragmentos, ARN viral de longitud completa puede ser generado por transcripción in vitro con ARN polimerasa T7. Tras la electroporación del ARN transcrito en las células, se recuperó el virus que exhibía cinética de crecimiento in vitro similar y fenotipos de virulencia e infección in vivo en ratones y mosquitos, respectivamente.
El virus Zika (ZIKV, Familia Flaviviridae : Género Flavivirus ) es un flavivirus transmitido por mosquitos que llegó a Brasil en 2013-14 y posteriormente se asoció con un brote masivo de enfermedad febril que se extendió a través de las Américas 1 . Además, ZIKV se ha relacionado con graves resultados de la enfermedad, como el síndrome de Guillain-Barré en adultos y microcefalia en fetos y neonatos [ 2] . Poco se sabía acerca de ZIKV antes de su rápida propagación en el hemisferio occidental. Esto incluyó la falta de herramientas moleculares, dificultando así la investigación mecanicista. Las herramien....
1. Transformación y recuperación de plásmidos de clones infecciosos
- Transformar ambos plásmidos (por separado) utilizando un protocolo de transformación comercial ( por ejemplo , NEB 5 Minute Transformation Protocol) con algunas modificaciones. Ambos plásmidos contienen un gen que codifica la resistencia a ampicilina, por lo tanto, usan ampicilina o carbenicilina para la selección. Se prefiere la carbenicilina, ya que es más estable.
- Retirar las células (ver tabla d.......
El protocolo descrito aquí permite la recuperación de virus Zika derivados de clones infecciosos. Manipular el sistema de clones infecciosos de dos plásmidos es sencillo cuando se realiza con cuidado, en comparación con las versiones de longitud completa que son altamente inestables (datos no mostrados). Después de la digestión y la ligación de las dos piezas distintas, ARN tapado se produce utilizando la transcripción in vitro con T7 polimerasa que luego se ele.......
Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode.......
Los autores desean agradecer a Kristen Bullard-Feibelman, a Milena Veselinovic ya Claudia Rückert por su ayuda en la caracterización del virus derivado de clones. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, NIH bajo las concesiones AI114675 (BJG) y AI067380 (GDE).
....| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
| Carbenicillin, Disodium Salt | various | ||
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
| ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
| SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20,000 units/ml |
| NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20,000 units/ml |
| ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/ml |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20,000 units/ml |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20,000 units/ml |
| HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20,000 units/ml |
| illustra TempliPhi 100 Amplification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/ml |
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10,000 units/ml |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | 400,000units/mL |
| HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| ECM 630 High Throughput Electroporation System | BTX | 45-0423 | Other machines are acceptable. |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma | L3147 | Can be homemade as well. |
| Terrific Broth | Sigma | T0918 | Can be homemade as well. |
| Petri Dish | Celltreat | 229693 | |
| Culture Tubes | VWR International | 60818-576 | |
| T75 flasks | Celltreat | 229340 | |
| T182 flasks | Celltreat | 229350 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| Tragacanth Powder | MP Bio | MP 104792 | |
| Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
| Ethanol Denatured | VWR International | BDH1156-1LP | |
| 6 well plate | Celltreat | 229106 | |
| 12 well plate | Celltreat | 229111 | |
| Sequencing Oligos | IDT | see table 1 | |
| Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | other methods are acceptable. |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher | Q32850 | other methods are acceptable. |
| Qubit RNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32852 | other methods are acceptable. |
| Class II Biosafety Cabinet | Varies | N/A | This is necessary for live-virus work. |
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