Räddning och karaktärisering av rekombinant virus från en ny världsinfektiös klon från Zika Virus

Detta protokoll beskriver återhämtningen av infektiös Zika-virus från en infektion med två plasmider med cDNA-klon.

Infektiösa cDNA-kloner möjliggör genetisk manipulation av ett virus, vilket underlättar arbetet med vacciner, patogenes, replikation, överföring och viral utveckling. Här beskriver vi konstruktionen av en infektiös klon för Zika-virus (ZIKV), som för närvarande orsakar ett explosivt utbrott i Amerika. För att förhindra toxicitet för bakterier som vanligen observeras med flavivirus-härledda plasmider genererade vi ett två-plasmidsystem som separerar genomet hos NS1-genen och är stabila än konstruktioner i full längd som inte lyckades återvinnas utan mutationer. Efter digestion och ligering för att ansluta till de två fragmenten, kan viralt RNA i full längd alstras genom in vitro transkription med T7 RNA-polymeras. Efter elektroporation av transkriberad RNA i celler erhölls virus som uppvisade liknande in vitro- tillväxtkinetik och in vivo virulens- och infektionsfenotyper hos respektive mus och myggor.

Zika-virus (ZIKV; Family Flaviviridae : Genus Flavivirus ) är ett myggburen flavivirus som anlände till Brasilien 2013-14 och var därefter associerat med ett massivt utbrott av febril sjukdom som spred sig över hela Amerika ¹ . Dessutom har ZIKV kopplats till svåra sjukdomsutfall, såsom Guillain-Barré-syndrom hos vuxna och mikrocefali hos foster och nyfödda ² . Lite var känt om ZIKV före dess snabba spridning på västra halvklotet. Detta innebar en brist på molekylära verktyg, vilket hindrade mekanisk forskning. Molekylära verktyg för virus, såsom infektiösa cDNA-kloner, underlättar vaccin och antiviral....

1. Transform och återvinning av smittsamma klonplasmider

1. Transformera båda plasmiderna (separat) med hjälp av ett kommersiellt transformationsprotokoll ( t.ex. NEB 5 Minute Transformation Protocol) med några modifieringar. Båda plasmiderna innehåller en gen som kodar för ampicillinresistens, använd därför ampicillin eller karbenicillin för selektion. Carbenicillin är föredraget, eftersom det är mer stabilt.
   1. Ta bort celler (se materialbord) från -80 ° C frys o.......

Protokollet som beskrivs här möjliggör återhämtning av infektiöst klon-härledd Zika-virus. Manipulering av infektiösa klonsystemet med två plasmider är rakt framåt när det utförs med försiktighet, jämfört med fulllängdsversioner som är mycket instabila (data ej visade). Efter matsmältning och ligering av de två distinkta bitarna framställs kapslat RNA genom in vitro- transkription med T7-polymeras, som sedan elektroporeras i Vero-celler (

Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode.......

Författarna vill tacka Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic och Claudia Rückert för deras hjälp för att karakterisera det klonbaserade viruset. Detta arbete stöddes delvis genom bidrag från National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH under bidrag AI114675 (BJG) och AI067380 (GDE).