Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
Bu protokol, iki-plazmid bulaşıcı bir cDNA klonundan bulaşıcı Zika virüsünün iyileşmesini tanımlıyor.
Enfeksiyöz cDNA klonları bir virüsün genetik manipülasyonuna izin verir, böylece aşılar üzerinde çalışma, patogenez, replikasyon, bulaşma ve viral evrimi kolaylaştırır. Burada Zika virüsü (ZIKV) için şu anda Amerika'da patlayıcı bir salgına neden olan bulaşıcı bir klonun yapımını anlatıyoruz. Flavivirüs kaynaklı plazmidlerle sıkça görülen bakterilere toksisiteyi önlemek için genomu NS1 geninde ayıran ve mutasyonsuz başarıyla kurtarılamayan tam uzunluktaki yapılardan daha kararlı olan iki plazmid sistemi ürettik. İki parçaya katılmak için sindirim ve ligasyondan sonra, T7 RNA polimeraz ile in vitro transkripsiyon ile tam uzunluktaki viral RNA üretilebilir. Transkribe RNA'nın hücrelere elektroporasyonundan sonra sırasıyla farelerde ve sivrisineklerde benzer in vitro büyüme kinetikleri ve in vivo virülans ve enfeksiyon fenotiplerini sergileyen virüs bulunmuştur.
Zika virüsü (ZIKV; Aile Flaviviridae : Genus Flavivirus ), 2013-14 yılları arasında Brezilya'ya gelen sivrisinek taşıyan bir flavivirüs olup, daha sonra Amerika Birleşik Devletleri'nde yaygınlaşan ateşli bir hastalık patlamasıyla ilişkilendirilmiştir 1 . Buna ek olarak, ZIKV, yetişkinlerde Guillain-Barré sendromu ve fetüsler ve yenidoğanlarda mikrocefali gibi ağır hastalık sonuçlarıyla bağlantılıdır2. Batı yarımkürede hızla yayılmadan önce ZIKV hakkında pek az şey biliniyordu. Bu, moleküler araçların eksikliğini içeriyordu, bu yüzden mekanistik araştırmayı engelledi. Bulaşıcı cDNA klonları gibi virüsler için moleküler....
1. Enfeksiyoz klon plasmidlerinin transformasyonu ve geri kazanımı
Burada açıklanan protokol, bulaşıcı klon türevi Zika virüsünün iyileşmesine izin verir. İki plazmid bulaşıcı klon sisteminin manipülasyonu, son derece dengesiz olan tam uzunluktaki versiyonlara kıyasla (bakınız veriler gösterilmemiştir), özen gösterildiğinde açıktır. Sindirimden ve iki ayrı parçanın bağlanmasından sonra, T7 polimeraz ile in vitro transkripsiyon kullanılarak kapaklı RNA üretilir ve daha sonra Vero hücrelerine elektroporasyon yap.......
Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode.......
Yazarlar Klon'dan türeyen virüsün karakterize edilmesine yardım ettikleri için Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic ve Claudia Rückert'e teşekkür etmek istiyorlar. Bu çalışma, Ulusal Allerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Enstitüsü (NIH) tarafından hibe AI114675 (BJG) ve AI067380 (GDE) altındaki hibelerden kısmen desteklenmiştir.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
Carbenicillin, Disodium Salt | various | ||
Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20,000 units/ml |
NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20,000 units/ml |
ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/ml |
EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20,000 units/ml |
BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20,000 units/ml |
HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20,000 units/ml |
illustra TempliPhi 100 Amplification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/ml |
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10,000 units/ml |
T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | 400,000units/mL |
HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
ECM 630 High Throughput Electroporation System | BTX | 45-0423 | Other machines are acceptable. |
LB Broth with agar (Miller) | Sigma | L3147 | Can be homemade as well. |
Terrific Broth | Sigma | T0918 | Can be homemade as well. |
Petri Dish | Celltreat | 229693 | |
Culture Tubes | VWR International | 60818-576 | |
T75 flasks | Celltreat | 229340 | |
T182 flasks | Celltreat | 229350 | |
1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose | Corning | 10-017-CV | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
Tragacanth Powder | MP Bio | MP 104792 | |
Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
Ethanol Denatured | VWR International | BDH1156-1LP | |
6 well plate | Celltreat | 229106 | |
12 well plate | Celltreat | 229111 | |
Sequencing Oligos | IDT | see table 1 | |
Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | other methods are acceptable. |
Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher | Q32850 | other methods are acceptable. |
Qubit RNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32852 | other methods are acceptable. |
Class II Biosafety Cabinet | Varies | N/A | This is necessary for live-virus work. |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved