Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

. כאן, עוצמת הכניסה אקראי בתיווך transposon של רכיב ה-DNA ללא קידוד שימש כדי לפתור את מעמדה כרומוזומלית אופטימלית.

Abstract

Position(s) כרומוזומליות אופטימלית של רכיב ה-DNA נתון היה/נקבעו על ידי הכניסה אקראי בתיווך transposon ואחריו כושר בחירה. בחיידקים, ההשפעה של הקשר הגנטי על הפונקציה של רכיב גנטי יכול להיות קשה להעריך. מספר מנגנונים, כולל אפקטים טופולוגי, מהפרעות תעתיק של גנים השכן, ו/או הקשורים שכפול גנטי המינון, עלול להשפיע על הפונקציה של רכיב גנטי נתון. כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת שילוב אקראי של רכיב ה-DNA לתוך הכרומוזום של Escherichia coli , בחר המיקומים מאהדה ביותר באמצעות תחרות גדילה פשוטה להתנסות. השיטה מנצלת מערכת מבוססת transposon היטב תיאר של הכניסה אקראי, יחד עם מבחר clone(s) ביותר על ידי צמיחה יתרון, הליך ניתנת להתאמה בקלות לצרכים ניסיוני. מהות clone(s) בכושר יכול להיקבע על ידי רצף הגנום כולו על אוכלוסיה מרובת המשובטים מורכבים או ג'ין קל של זיהוי מהיר של שיבוטים שנבחרו. כאן, באזור ה-DNA ללא קידוד DARS2, השולטת אתחול של הכרומוזום ב e. coli, שימש כדוגמה. הפונקציה של DARS2 ידוע להיות מושפעות המינון הקשורים שכפול גנטי; קרובה יותר DARS2 על מוצאם של שכפול ה-DNA, פעיל יותר זה נעשה. DARS2 הוכנס באופן אקראי לתוך הכרומוזום של DARS2-נמחק זן. שיבוטים הנובעת המכילה הוספות בודדים היו איחדו, התחרו אחד נגד השני במשך מאות דורות. לבסוף שיבוטים בכושר היו מאופיין, יתחוור DARS2 מוכנס בסמיכות למיקום DARS2 המקורי.

Introduction

הפונקציה של כל רכיב גנטי עשויה להיות מושפעת מיקומו הגנום. בחיידקים, זה בעיקר נובע הפרעה על ידי שעתוק של גנים השכן, טופולוגיה DNA מקומיים, ו/או הקשורים שכפול גנטי המינון. בפרט, תהליכי שכפול ה-DNA, סגרגציה נשלטים, לפחות בחלקו, לפי אזורים כרומוזומלית ללא קידוד1ו לתפקוד תקין של אזורים אלה תלוי מיקום גנומית/הקשר. ב- e. coli, דוגמאות באתר dif , הדרושים עבור אחותי ברזולוציה של כרומוזום2; רצפים KOPS, נדרש כרומוזום סגרגציה3; ואת הנתונים, DARS1ואזורי DARS2 , הנדרשים לשליטה נכונה הכרומוזום (להלן; 4). אנו מציגים שיטה ומאפשר רילוקיישן אקראי, בחירה ונחישות של הקשר הגנטי אופטימלית של כל רכיב גנטי מסוים, כאן כשניסחתי חקר האזור ללא קידוד DARS2 .

ב- e. coli, DnaA הוא החלבון יוזם ממונה על צירוף ד. נ פתיחת שכפול יחיד מוצאoriC, ועל הגיוס של הליקאז DnaB5,6,7. DnaA שייך AAA+ (קרי, ATPases הקשורים עם פעילויות מגוונות) חלבונים יכולים לאגד הן ATP ו ADP עם גבוה דומה הזיקות5. הרמה של DnaAATP פסגות-חניכה8, איפה DnaAATP מתפתח multimer על oriC , זה מעורר דנ א דופלקס פתיחה9. לאחר החניכה, oriC עשוי אינו זמין באופן זמני עבור אתחול מחדש עקב פחמיות באמצעות מנגנון המערבים את הכריכה של החלבון SeqA כדי hemimethylated oriC10,11. במהלך פחמיות, הרמה של DnaAATP הוא מופחת על ידי לפחות שני מנגנונים: איון הרגולציה של 12,DnaA (רידא)13 ונתונים-תלוי DnaAATP הידרוליזה (DDAH)14 ,15. רידא והן DDAH לקדם את ההמרה של DnaAATP DnaAADP. לפני סבב חדש של חניכה, DnaAADP הוא מופעל מחדש כדי DnaAATP -רצפים ספציפיים הפעלה מחדש-של DnaA (DARS):16, DARS1 ו- DARS217. כרומוזומלית נתונים, DARS1, וDARS2 הם ללא קידוד ולהתנהג בצורה דמוית המלווה כדי לווסת את DnaAATP/DnaAADP interconversion. אזורים אלה, הממוקם מחוץ המקור של שכפול, לאפשר ההרכבה של DnaA מורכבים גם איון (נתונים; 14) או ההפעלה (DARS1 , DARS2; 17) של DnaA. מחיקת DARS2 בתא אינו משנה זמן ההכפלה המוני, אך יוצרת שכפול אסינכרוני חניכה15,16,18. עם זאת, DARS2-הלקוי ולתאים יש כושר בהשוואה wildtype isogenic אחרת במהלך שני תחרות צמיחה מתמשכת במדיום עשיר או במהלך הקמת מושבת המעי העכבר18. אפשרות זו מציינת כי שינויים קלים אפילו בריכוז asynchrony/מקור יש השפעה שלילית על כושר חיידקי. E. coli, יש לחץ סלקטיבי כדי לשמור על סימטריה (קרי, שני אורך כמעט שווה שכפול נשק) כרומוזום19. הנתונים, DARS1ואזורי DARS2 יש את המרחק היחסי באותו oriC בתוך כל e. coli זנים וסודרו18, למרות וריאציות גדול בגודל כרומוזום.

כאן, אנו משתמשים האזור DARS2 של e. coli כדוגמה לצורך זיהוי position(s) כרומוזומלית האופטימלית עבור תפקידה. DARS2 הוכנס לתוך transposon את NKBOR, את NKBOR תוצאות:: transposonDARS2 לאחר מכן מוכנס באופן אקראי לתוך הגנום של MG1655 ΔDARS2. לכן יצרנו אוסף של תאים, פו-טי כל DARS2 להציב במקום אחר על כרומוזום ה. במבחנה תחרות ניסוי, בו כל התאים באוסף היו איחדו, התחרו אחד נגד השני במהלך צמיחה מתמשכת ב- LB דורות 700 מוערך, בוצעה. תוצאת הניסוי תחרות פיקוח/נקבע באמצעות תספיג דנ א, ג'ין קל הליכה רצף הגנום כולו (WGS; איור 1). שיבוטים מובילים נפתרה על ידי ג'ין קל הליכה התאפיינו cytometry זרימה כדי להעריך את מחזור התא בפרמטרים. בניתוח cytometric זרימה, ניתן למדוד גודל תא, תוכן ה-DNA, חניכה synchrony עבור מספר גדול של תאים. במהלך cytometry זרימה, עובר זרם של תאים בודדים קרן אור של הגל המתאים כדי לרגש מוכתם הדנ א, אשר לאחר מכן נרשם בו זמנית על-ידי photomultipliers אוספים את הנפלט פלורסצנטיות, מידה של תוכן ה-DNA, בתנאי תאים מוכתמים לדנ א. האור מפוזר-קדימה הוא מדד של המוני תאים20.

במבחנה תחרות הניסוי שאנו מציגים כאן משמש כדי לטפל בשאלות המתייחסות חשיבות המיקום כרומוזומליות ואת ההקשר גנומית של רכיב גנטי. השיטה זו לא משוחד, קל לשימוש.

Protocol

1. האוסף של ספריית Transposon

הערה: מיקומה DARS2 כרומוזומליות היה משובטים לתוך ה Tn מיני 10-מבוסס transposon, NKBOR (על pNKBOR) 21, וכתוצאה מכך NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR ניתן להשיג באינטרנט 22. pNKBOR הוא וקטור התאבדות מבוססי R6K הדורשת את π חלבון יוזם עבור שכפול 23. פלסמיד pJFM1 לכן אפשרות לשכפל בזן e. coli (למשל, Dh5α λ pir) המכיל עותק כרומוזומליות של הגן פיר. עם זאת, כאשר pJFM1 הוא הופך את wildtype חשוכת-פיר MG1655, pJFM1 אין אפשרות לבצע שכפול, שמוביל הבחירה של שיבוטים עמידים kanamycin שנוצר על ידי הוספות אקראי של NKBOR:: DARS2 לתוך הכרומוזום חיידקי. פשטות, אלה מכונים DARS2 הוספות. ראה איור 1 למצגת סכמטי של המתודולוגיה.

  1. הכנת electrocompetent MG1655 Δ DARS2 לגדול באופן פעיל תאי Lysogeny מרק בשר (LB) גדל ב- 37 מעלות צלזיוס 24.
  2. PJFM1 Electroporate לתוך Δ electrocompetent MG1655 DARS2, על-פי גונזלס. et al. 24
    1. 1 להוסיף µg של pJFM1 (ב µL 1 מים) ל- 40 µL של electrocompetent MG1655 e. coli Δ DARS2 ולהעביר תערובת זו cuvette הפער 0.2 ס מ מראש צוננת, סטרילי. הוסף את cuvette אל החדר אלקטרופורציה. Electroporate בגיל 18 kV, Ω 500 ו- 25 µF; קבוע הזמן צריך להיות ~5.0 ms, אין הפרוסים כקשת צריכה להתרחש.
    2. במהירות לשחזר את המתלים חיידקי על-ידי resuspending אותו בבית 1 מ"ל של מרק LB מראש ומחוממת והעברתן ל- 15 מ"ל מבחנה.
    3. לתת את התאים לשחזר על-ידי המקננת תחת תנאי הגידול קצף ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ללא בחירה לאנטיביוטיקה. צלחת את החיידקים על פלטות אגר LB בתוספת 50µg/mL kanamycin, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  3. לספור את המושבות של אלקטרופורציה: מושבה אחת נחשב שווה להכניסה transposon כרומוזומליות אחד.
    הערה: המושבות אפשר לסמוך על-ידי העין או עם מונה המושבה. המספר של המושבות הוא ביחס הפוך ל המרחק הממוצע של טרנספוזונים ממוקם הכרומוזום של כל המשובטים.
  4. להוסיף 1 מ ל ציר LB לכל צלחת ולשטוף את כל מושבות; 1 מ"ל LB מרק צריך להספיק לשטוף ~ 100,000 מושבות. שימוש חוזר באותו mL 1 LB מרק כדי להעלות את ריכוז חיידקי. בריכה כל המושבות לשפופרת 50 מל אותו.
  5. מערבולת הצינור ומקפיאים את החומר התחלה (t = 0). כדי להקפיא אותו, מערבבים 1 מ"ל של השעיה תא עם 1 מ"ל של גליצרול 50% על קרח. העברת הצינורות להתייבש קרח למשך 10 דקות. פעם אחת התרבויות מוקפאים, להעביר אותם ל-80 מעלות צלזיוס מקפיא.
    הערה: ריכוז תאי של לפחות 50,000 CFU/mL צפויה בשלב זה.

2. תחרות בניסוי LB

  1. הפשרה הספרייה transposon מ-80 מעלות צלזיוס על קרח. מיקס מאת pipetting.
  2. µL 100 העברה של הספרייה transposon עד 10 מ"ל של LB במבחנה 15 מ"ל.
  3. לגדל את התאים, מוגזים ע י ניעור רציפה (250 סל"ד), עבור 8 שעות ב 37 ° C לשלב נייח (קרי, OD 600 = ~ 4.0). כוונן את הפרמטרים האלה לתנאי גידול שונים, בהתאם לרצונך.
  4. הפצת האוכלוסייה חיידקי העברות בנקאיות רציף לתוך בינוני prewarmed טריים בכל הדורות ~ 10. עושים זאת על ידי העברת 10 µL של התרבות הקודם שלב נייח 10 מ ל LB טריים, גדל עבור עוד 8 שעות לשלב נייח (קרי, OD 600 = ~ 4.0).
    הערה: כפי הצפיפות האופטית ההתחלה והסיום זהים, לדילול 1,000-fold מקביל ~ 10 דורות של צמיחה (2 10 = 1,024). האוכלוסייה חיידקי יכול להיות מופצות ישירות לתוך בינוני prewarmed טריים או שנשמרה ברזולוציה של 0-4 ° C (על קרח), הופץ ביום המחרת. LB שימש כאן כדי להבטיח כמה שיותר הטווח הסלולר ב במועד ככל האפשר (זמן הכפלה קרוב 22 דקות).
  5. לאחר כל הדורות 100 של תחרות, לשמור חמש דוגמאות 1-mL ב-80 מעלות צלזיוס (כפי שמתואר בשלב 3.3).
  6. אם כושר ההבדלים בין תאים המכילה הוספות transposon בודדים צפויים להיות קטן, לשמור על משך הזמן של תחרות זמן; כאן, דורות 700 (t = 700) שימשו.

3. ניתוח כתם הדרומי כדי לפקח על הניסוי התחרות לאורך זמן

  1. להכין רגש הדרומי חשופה (סעיף 1-kb של NKBOR) על-ידי ביצוע פולימראז תגובת שרשרת (PCR) הגברה באמצעות תחל ספציפיים: NKBOR_Probe_FW : gatgttggacgagtcggaat, NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt.
    1. Incubate ב 98 ° C ל 30 s דנטורציה הראשונית. לאחר מכן, לבצע מחזורים 35 ב 98 ° C עבור 10 s, 60 ° C ל 30 s, ו- 72 מעלות צלזיוס במשך 45 s. עבור סיומת הסופי, השתמש 72 ° C עבור 10 דקות
      הערה: התבנית עבור התגובה PCR היה פלסמיד מטוהרים pNKBOR 21.
    2. תווית השבר PCR תוצאות עם dATP [α - 32P] באמצעות מערכת פריימר אקראי, לפי סמית 25.
  2. להכין את הדנ א סלולרי הכולל לפי Løbner-Olesen ו- Freiesleben פון 26 t = 0 ונבחרת עת נקודות עד t = 700 מוערך דורות של תחרות.
  3. לעכל את הדנ א סלולרי הכולל עם Pvu הראשון, אשר חותך את NKBOR המכיל אזור עניין פעם אחת בלבד באזור לא מכוסה על ידי החללית; 1 יחידה של Pvu אני יכול לשמש כדי לחלוטין תקציר 1 µg של מצע דנ א.
    הערה: המכשיר יזהה שברי המכיל חלק של transposon, יחד עם DNA כרומוזומלית באורכים שונים, בהתאם האתר ההכנסה.
  4. לבצע את תספיג דנ א באמצעות ג'ל agarose כ- 0.7% על פי Løbner-Olesen ו- Freiesleben פון 26.

4. זיהוי של שיבוטים בכושר

  1. שימוש קל ג'ין הליכה, כפי שתואר על ידי הריסון. et al. 27, ולזהות אתרים ההכנסה DARS2 מן שיבוטים יחיד (מבודד על צלחות ליברות) לאחר 700 דורות המשוערת של תחרות; הלהקות יותר על תספיג דנ א, מבודד יותר יש צורך לכסות את כל הוספות transposon. דנ א גנומי
    1. לנתק את תבנית ה-PCR. להפיץ חיידקים על צלחת אגר LB המכיל 50 µg/mL kanamycin, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לגדול מושבות יחיד לילה ב- LB מרק ב 37 מעלות צלזיוס, לאחר מכן להעביר 20 µL µL 200 של מים מזוקקים בלוק (או השתמש טיהור DNA, כמו שלב 3.2).
      1. מערבולת לערבב. מחממים את התערובת ב 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, צנטריפוגה-מהירות מקסימלית עבור 5 דק להציל את התא lysate ב-20 ° C לשימוש עתידי.
    2. עיצוב שלוש תחל מקוננת כדי anneal בתוך transposon של בחירה (לקבלת ייצוג גרפי של האסטרטגיה PCR, ראה איור 2).
      הערה: עיצוב תחל מקונן עליך לוודא מקונן 3 פריימר שקרים הקרוב למקום ה-5 ידוע ' סוף transposon ה-DNA, ואחריו מקונן תחל 2 ו-1. המרווח בין מקונן פריימר 3 ו- 5 ' סוף ה-t ידועותransposon DNA תצטרך להסתפק רצף הקריאה מן ה-DNA הידוע ל- DNA לא ידוע (כדי למצוא אתר ההכנסה transposon כרומוזומלית מסוימת). עבור NKBOR שימשו את תחל מקוננים הבאים: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg, ו pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg. תחל אקראי המכיל האתרים זיהוי של אנזימי הגבלה ידועה משמשים גם. כדי להבטיח תוצאה, יש להשתמש לפחות שני צבעי יסוד אקראיים שונים. האתרים ההגבלה אנזימי הגבלה (e.g.,Sau 3איי, תרטר הין) צריך להיות ממוקם ב 3 ' סוף ולפניו בסיסים אקראיים עשר אז זה 5 ' - NNNNNNNNNNGATC - 3 ', 5 ' - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 ' הם תחל המכיל את אתר 3איי סאו (GATC) ואתר תרטר הין (AAGCTT), בהתאמה, שבו N = A, T, G או ג
    3. שימוש 200 ng של דנ א גנומי ב 20 µL PCR התגובה. דגירה ב 98 ° C ל 30 s עבור דנטורציה הראשונית. לבצע מחזורים 25 ב 98 ° C ל 30 s, 50 ° C 15 s, ו- 72 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. עבור סיומת הסופי, השתמש 72 ° C לזוגות 10 דקות שימוש תחל המורכב מקונן פריימר 1 ו לאחד תחל אקראי.
    4. השתמש פריימר זוגות המורכב מקונן 2 פריימר ו מן המפתח אקראי אותו מ הגברה השנייה, באמצעות µL 1 של התגובה הקודמת שלה כתבנית.
    5. חזור על שלב 4.1.4 עם זוגות תחל המורכב מקונן פריימר 3 ו מן המפתח אקראי אותו.
    6. להפעיל את המוצרים התגובה PCR הסופי ב- 1.5% agarose ג'ל עם הכתם עם אתידיום ברומיד. לגזור להקה בטווח 100-800 bp ולבודד את הדנ א באמצעות כל ג'ל DNA מסחרי חילוץ הערכה על פי היצרן ' s כיוון. Resuspend ה-DNA ב 15 µL של מים-
      הערה: זהירות. אתידיום ברומיד הוא רעיל, יש לטפל בזהירות.
    7. רצף של הלהקה מבודד בשלב הקודם (שלב 4.1.6), עם 3 פריימר מקונן בתור פריימר רצף, באמצעות סנגר רצף-ספק מסחרי.
  2. לבצע WGS-
    1. לבצע WGS על הסכום הכולל מופק דנ א נבחר הדגימות שנאספו במהלך הניסוי התחרות, כפי שתואר על ידי Frimodt-הנקבה ואח 4.
  3. לבצע ניתוח רצף.
    1. יישור לזווג-end מקריאה 150 Ns רציפים כדי NKBOR, AF310136.1 1,904 … 2,204 באמצעות Bowtie2 28 במרווח בין זרע מחרוזות (S, 1, 1.15) מספר מרבי של דמויות מעורפלות (L, 0, 0.9).
    2. בחר את קריאות מיושר ולאחר מכן ליישר מחדש בשני ref MG1655 | NC_000913.3, NKBOR ג'יגה-בתים | AF310136 באמצעות blastN 29
    3. להקצות טרנספוזיציה ההכנסה עמדות ובצמתים MG1655-NKBOR.

5. Flow Cytometry

  1. לאסוף דגימות עבור cytometry זרימה.
    1. איזון כל תרבות על ידי שמירה על זה בשלב הגידול האקספוננציאלי לפחות 10 דורות. בדוק את יתר 600 ולהבטיח כי זה אף פעם לא עולה 0.3-
    2. לאסוף שני סוגי זרימה דגימות.
      1. על ריף-עצירה, העבר 1 מ"ל של תרבות צינור 15 מ"ל המכיל 30 µL של ריף-CEF (300 µg/mL ריפאמפיצין, 36 µg/mL cephalexin מומס 12.5 מ מ NaOH). להשאיר את זה ב 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 4 שעות של טלטולים.
        הערה: ריפאמפיצין חוסם בעקיפין אתחול של הכרומוזום תוך מתן אפשרות לביקור מתמשך של שכפול להמשיך סיום. Cephalexin מונע חלוקת התא, כשהתוצאה היא שכפול רנאאוט (ריף-עצירה) ואת ההצטברות של תאים עם כרומוזומים משוכפלים באופן מלא. מספר הכרומוזומים משוכפלות באופן מלא שווה למספר מקורות בזמן הטיפול עם ריפאמפיצין, cephalexin 20-
      2. עבור המדגם-EXP, העברת 1 מ"ל של שמתקדמות תרבות של צינור 1.5-mL על קרח
  2. לתקן את התאים כדלקמן. לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 15,000 g x עבור 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס Resuspend בגדר ב 100 µL של 10 מ מ קרה כקרח טריס pH 7.5 ולהוסיף 1 מ"ל אתנול 77% קר כקרח. לאחסן את הדגימות ב 4 ° C עד שימוש.
  3. מכתים את התאים כדלקמן. הקציר 100-300 µL של תאים קבוע על ידי צנטריפוגה ב 15,000 g x עבור 15 דקות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב- 130 µL של " פתרון ה-DNA מכתים " (90 mithramycin µg/mL, 20 µg/mL אתידיום ברומיד, 10 מ מ MgCl 2 ו- 10 מ"מ טריס pH 7.5). לשים את הדוגמאות על קרח, בחשיכה; הדגימות מוכנים לניתוח cytometry זרימה לאחר 10 דקות
    הערה: DNA אחרים כתמי מאשר אתידיום ברומיד, mithramycin ניתן גם בשימוש 30 , 31-
  4. לקבוע את המקור לכל תא, המסה יחסיות לתאים ואת תוכן ה-DNA יחסית על ידי ניתוח cytometry זרימה.
    1. בצע cytometry זרימה, כפי שתואר לעיל 32. הפעל ריף-רנאאוט ודוגמאות EXP-באמצעות זרימת cytometer היצרן ' s הוראות . עבור mithramycin - ו אתידיום ברומיד שהוכתמו תאים, השתמש עירור אורכי גל 395, 440 ננומטר ולאסוף את זריחה מעל 565 ננומטר.
      1. כדי לקבוע את יחסיות לתאים המוני יחסית DNA ותוכן, להפעיל הדוגמאות-EXP כדי להשיג פיזור אור קדימה פרמטר אחד לעומת היסטוגרמות מספר התא ועוצמת קרינה פלואורסצנטית לעומת תא היסטוגרמות מספר מינימום של אירועים 30,000 המתאים לאות תא.
      2. שימוש מפוזרים קדימה אור פרמטר אחד הפצה כדי למדוד היחסית הממוצעת תא מסצ'וסטס
        הערה: אור מפוזר-קדימה הוא מדד של המוני תא ממוצע 20-
      3. שימוש פלורסצנטיות העוצמה הפצות פרמטר אחד כדי למדוד את ה-DNA הממוצע תוכן 20-
      4. להשיג את ריכוז הדנ א כיחס של תוכן ה-DNA הממוצע המוני תא ממוצע 20-
    2. לקבוע את מספר מקורות בכל תא.
      1. בניהול ריף-רנאאוט הדוגמאות כדי להשיג עוצמת קרינה פלואורסצנטית פרמטר אחד לעומת תא היסטוגרמות מספר מינימום של 30,000 אירועים התואמים האות תא.
      2. שימוש פלורסצנטיות העוצמה הפצות פרמטר אחד כדי לקבוע את מספר כרומוזומים בכל תא 20-
  5. לחשב מדד asynchrony (Ai).
    1. חישוב Ai, כפי שתואר על ידי. Løbner-Olesen et al. 32, באמצעות פרמטר יחיד עוצמת קרינה פלואורסצנטית חלוקות של הדגימות ריף-עצירה ו- Ai הנוסחה = (f3 + f5 + f6 + f7) / (f2 + f4 + f8), איפה fx התאים שבר עם x מספר כרומוזומים משוכפלים באופן מלא. שקול חנוכת אסינכרוני כאשר A > 0.1-

תוצאות

תספיג דנ א נעשתה כדי לוודא DARS2 הופץ באופן אקראי בכל הכרומוזום בספריה transposon (t = 0) וכי שיבוטים בכושר נמשכות לאורך זמן. תספיג דנ א בוצעה ב- DNA שחולצו מן הבריכה transposon הראשונית (ב- t = 0), כל 100 מוערך מתוך 700 דורות של תחרות (איור 3). כאן לדנ א הסלולר סך כל הזמן-נקודה ה...

Discussion

המתודולוגיה בשימוש כאן מנצל המדינה-of-the-art טכניקות כדי לענות על שאלה קשה בנוגע המיקום האופטימלי גנומית של רכיב גנטי. הכניסה אקראי של הרכיב הגנטי (בתיווכו של transposon) מאפשר את האוסף קלה ומהירה של אלפי שיבוטים, אשר לאחר מכן ניתן יהיה לעשות מתחרות זו בזו כדי לבחור את המיקום האופטימלי של הרכיב הגנ?...

Disclosures

המחברים שאין עניין פיננסי מתחרות.

Acknowledgements

המחברים היו במימון מלגות קרן נובו נורדיסק, קרן לונדבק, דנית מחקר הקרן הלאומית (DNRF120) דרך המרכז תגובת המתח חיידקי, התמדה (BASP).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Autoclaved Mili-Q waterNone
Electroporation Cuvettes, 0.1 cmThermo Fisher ScientificP41050
Bio-Rad MicroPulser Electroporation SystemBio-Rad165-2100
LB BrothThermo Fisher Scientific12780029 
LB Agar, powder (Lennox L agar)Thermo Fisher Scientific22700025
GlycerolThermo Fisher Scientific17904
Fisherbrand Plastic Petri DishesFisher ScientificS33580A
Falcon 50mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific14-432-22
Falcon 15mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific14-959-53A
Nunc CryoTubesSigma-AldrichV7634 
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL)Thermo Fisher ScientificF530S
dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCiPerkinElmerBLU012H250UC
DECAprime II DNA Labeling KitThermo Fisher ScientificAM1455
Spectrophotometer  SF/MBV/03.32Pharmacia
Hermle Centrifuge    SF/MBV/03.46Hermle
Ole Dich Centrifuge  SF/MBV/03.29Ole Dich
Eppendorftubes 1.5 mLSigma-AldrichT9661
Eppendorftubes 2.0 mLSigma-AldrichT2795
Sodium ChlorideMerck6404
96% EthanolSigma-Aldrich16368
Trizma HClSigma-AldrichT-3253
Phenol Ultra PureBRL5509UA
ChloroformMerck2445
Ribonuclease A type II ASigma-AldrichR5000
Sodiumdodecylsulphate (SDS)Merck13760
LysozymeSigma-AldrichL 6876
IsopropanolSigma-Aldrich405-7
0.5M Na-EDTA pH 8.0BRL5575 UA
Kanamycin sulfateSigma-Aldrich10106801001
PvuI (10 U/µL)Thermo Fisher ScientificER0621
UltraPure AgaroseThermo Fisher Scientific16500500
DNA Gel Loading Dye (6X)Thermo Fisher ScientificR0611
Tris-Borate-EDTA bufferSigma-AldrichT4415
Ethidium bromideSigma-AldrichE7637
Hydrochloric acidSigma-Aldrich433160
Sodium HydroxideSigma-Aldrich71687
Whatman 3MM papersSigma-AldrichWHA3030931
SSC Buffer 20× ConcentrateSigma-AldrichS6639
Amersham Hybond-N+GE HealthcareRPN119B
Ficoll 400Sigma-AldrichF8016
PolyvinylpyrrolidoneSigma-AldrichPVP40
Bovine Serum Albumin - Fraction VSigma-Aldrich85040C
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testesSigma-AldrichD1626
Carestream Kodak  BioMax  light filmSigma-AldrichZ373494
GenElute  Gel Extraction KitSigma-AldrichNA1111 
GenElute  PCR Clean-Up KitSigma-AldrichNA1020
T100  Thermal CyclerBio-Rad
SmartSpec Plus SpectrophotometerBio-Rad
RifampicinServa34514.01
CephalexinSigma-AldrichC4895
MithramycinServa29803.02
Magnesium chloride hexahydrateSigma-Aldrich246964
Apogee A10 instrumentApogee

References

  1. Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Lobner-Olesen, A. Control of bacterial chromosome replication by non-coding regions outside the origin. Curr Genet. , (2016).
  2. Sherratt, D. J., et al. Recombination and chromosome segregation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 359 (1441), 61-69 (2004).
  3. Bigot, S., et al. DNA motifs that control E. coli chromosome segregation by orienting the FtsK translocase. EMBO J. 24 (21), 3770-3780 (2005).
  4. Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. DNA Replication Control Is Linked to Genomic Positioning of Control Regions in Escherichia coli. PLoS Genet. 12 (9), 1006286 (2016).
  5. Kornberg, A., Baker, T. A. . DNA Replication, Second Edition. , (1992).
  6. Kaguni, J. M. Replication initiation at the Escherichia coli chromosomal origin. Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 606-613 (2011).
  7. Leonard, A. C., Grimwade, J. E. Regulation of DnaA assembly and activity: taking directions from the genome. Annu Rev Microbiol. 65, 19-35 (2011).
  8. Kurokawa, K., Nishida, S., Emoto, A., Sekimizu, K., Katayama, T. Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli. EMBO J. 18 (23), 6642-6652 (1999).
  9. Sekimizu, K., Bramhill, D., Kornberg, A. ATP activates dnaA protein in initiating replication of plasmids bearing the origin of the E. coli chromosome. Cell. 50 (2), 259-265 (1987).
  10. Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. EMBO J. 18 (8), 2304-2310 (1999).
  11. Lu, M., Campbell, J. L., Boye, E., Kleckner, N. SeqA: a negative modulator of replication initiation in E. coli. Cell. 77 (3), 413-426 (1994).
  12. Katayama, T., Kubota, T., Kurokawa, K., Crooke, E., Sekimizu, K. The initiator function of DnaA protein is negatively regulated by the sliding clamp of the E. coli chromosomal replicase. Cell. 94 (1), 61-71 (1998).
  13. Kato, J., Katayama, T. Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli. EMBO J. 20 (15), 4253-4262 (2001).
  14. Kasho, K., Katayama, T. DnaA binding locus datA promotes DnaA-ATP hydrolysis to enable cell cycle-coordinated replication initiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 936-941 (2013).
  15. Kitagawa, R., Ozaki, T., Moriya, S., Ogawa, T. Negative control of replication initiation by a novel chromosomal locus exhibiting exceptional affinity for Escherichia coli DnaA protein. Genes Dev. 12 (19), 3032-3043 (1998).
  16. Fujimitsu, K., Senriuchi, T., Katayama, T. Specific genomic sequences of E. coli promote replicational initiation by directly reactivating ADP-DnaA. Genes Dev. 23 (10), 1221-1233 (2009).
  17. Kasho, K., Fujimitsu, K., Matoba, T., Oshima, T., Katayama, T. Timely binding of IHF and Fis to DARS2 regulates ATP-DnaA production and replication initiation. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13134-13149 (2014).
  18. Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. Control regions for chromosome replication are conserved with respect to sequence and location among Escherichia coli strains. Front Microbiol. 6, 1011 (2015).
  19. Bergthorsson, U., Ochman, H. Distribution of chromosome length variation in natural isolates of Escherichia coli. Mol Biol Evol. 15 (1), 6-16 (1998).
  20. Boye, E., Steen, H. B., Skarstad, K. Flow cytometry of bacteria: a promising tool in experimental and clinical microbiology. J Gen Microbiol. 129 (4), 973-980 (1983).
  21. Rossignol, M., Basset, A., Espeli, O., Boccard, F. NKBOR, a mini-Tn10-based transposon for random insertion in the chromosome of Gram-negative bacteria and the rapid recovery of sequences flanking the insertion sites in Escherichia coli. Res Microbiol. 152 (5), 481-485 (2001).
  22. Shafferman, A., Helinski, D. R. Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K. J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).
  23. Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. J Vis Exp. (80), (2013).
  24. Smith, D. R. Random primed labeling of DNA. Methods Mol Biol. 18, 445-447 (1993).
  25. Lobner-Olesen, A., von Freiesleben, U. Chromosomal replication incompatibility in Dam methyltransferase deficient Escherichia coli cells. EMBO J. 15 (21), 5999-6008 (1996).
  26. Harrison, R. W., Miller, J. C., D'Souza, M. J., Kampo, G. Easy gene walking. Biotechniques. 22 (4), 650-653 (1997).
  27. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  28. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  29. Stepankiw, N., Kaidow, A., Boye, E., Bates, D. The right half of the Escherichia coli replication origin is not essential for viability, but facilitates multi-forked replication. Mol Microbiol. 74 (2), 467-479 (2009).
  30. Lobner-Olesen, A. Distribution of minichromosomes in individual Escherichia coli cells: implications for replication control. EMBO J. 18 (6), 1712-1721 (1999).
  31. Lobner-Olesen, A., Skarstad, K., Hansen, F. G., von Meyenburg, K., Boye, E. The DnaA protein determines the initiation mass of Escherichia coli K-12. Cell. 57 (5), 881-889 (1989).
  32. Carver, T., Thomson, N., Bleasby, A., Berriman, M., Parkhill, J. DNAPlotter: circular and linear interactive genome visualization. Bioinformatics. 25 (1), 119-120 (2009).
  33. Eckert, S. E., et al. Retrospective application of transposon-directed insertion site sequencing to a library of signature-tagged mini-Tn5Km2 mutants of Escherichia coli O157:H7 screened in cattle. J Bacteriol. 193 (7), 1771-1776 (2011).
  34. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
  35. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
  36. Jeong, H., Lee, S. J., Kim, P. Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat. J Vis Exp. (115), (2016).
  37. Bryant, J. A., Sellars, L. E., Busby, S. J., Lee, D. J. Chromosome position effects on gene expression in Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Res. 42 (18), 11383-11392 (2014).
  38. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

127transposoncytometry

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved