Determinazione dei percorsi cromosomici ottimali per un elemento di DNA in Escherichia coli usando un approccio novello Transposon-mediata

Riepilogo

Qui, il potere di un'inserzione casuale transposon-mediata di un elemento di DNA non codificante è stato usato per risolvere la sua ottimale posizione cromosomica.

Abstract

Le posizioni cromosomiche ottimale di un dato elemento di DNA è stato/sono state determinate mediante inserimento casuale transposon-mediata seguita dalla selezione di fitness. Nei batteri, l'impatto del contesto genetico sulla funzione di un elemento genetico può essere difficile da valutare. Parecchi meccanismi, compreso gli effetti topologici, interferenza trascrizionale da geni vicini, e/o dosaggio genico replica-collegato, possono influenzare la funzione di un dato elemento genetico. Qui, descriviamo un metodo che consente l'integrazione casuale di un elemento di DNA nel cromosoma di Escherichia coli e selezionare le posizioni più favorevoli utilizzando una concorrenza crescita semplice esperimento. Il metodo si avvale di un sistema basato su trasposone ben descritto di inserimento casuale, accompagnato da una selezione del clone(s) più adatto nel vantaggio di crescita, una procedura che è facilmente regolabile per esigenze sperimentali. La natura del clone(s) più adatto può essere determinata mediante sequenziamento intero genoma su una popolazione multi-clonale complesso o dal gene facile a piedi per la rapida identificazione di cloni selezionati. Qui, la regione di DNA non codificante DARS2, che controlla l'avvio della replica del cromosoma in e. coli, è stata usata come esempio. La funzione di DARS2 è noti per essere interessati da dosaggio genico replica-collegato; il più vicino DARS2 Ottiene l'origine di replicazione del DNA, diventa più attivo. DARS2 casualmente è stato inserito nel cromosoma di un DARS2-eliminato il ceppo. I cloni risultanti contenente singoli inserimenti sono stati riuniti ed ha gareggiati uno contro l'altro per centinaia di generazioni. Infine, i cloni più adatti sono stati caratterizzati e trovati per contenere DARS2 inserita nella prossimità vicina alla posizione originale di DARS2 .

Introduzione

La funzione di qualsiasi elemento genetico può essere influenzata dalla sua posizione nel genoma. Nei batteri, questo dipende principalmente da interferenze dalla trascrizione di geni vicini, topologia del DNA locale e/o dosaggio genico replica-collegata. In particolare, i processi di replicazione del DNA e di segregazione sono controllati, almeno in parte, di regioni cromosomiche non codificanti¹e la funzione di queste regioni dipende dalla posizione/contesto genomico. In e. coli, gli esempi sono il sito di dif , necessario per la sorella del cromosoma risoluzione²; Sequenze KOPS, richiesti per di segregazione del cromosoma³; dati, DARS1e regioni DARS2 , necessarie per il controllo della corretta replica cromosomica (sotto; ⁴). vi presentiamo un metodo che consente il trasferimento casuale, selezione e determinazione del contesto genetico ottimo di ogni singolo elemento genetico, esemplificato qui dallo studio della regione non codificante DARS2 .

In e. coli, DnaA è la proteina di iniziatore responsabile filo del DNA di apertura presso la replica singola origineoriCe per l'assunzione di elicasi DnaB^5,6,7. DnaA appartiene alla AAA⁺ (cioè, ATPasi associata con attività diverse) proteine e può legare ATP e ADP con simile ad alta affinità⁵. Il livello di DnaA^ATP picchi a iniziazione⁸, dove DnaA^ATP forma un multimer su oriC che innesca il DNA duplex apertura⁹. Dopo l'inizio, oriC fatta temporaneamente non disponibile per riattivazione a causa del sequestro di un meccanismo che coinvolge l'associazione della proteina SeqA per hemimethylated oriC^10,11. Durante il sequestro, il livello di DnaA^ATP è ridotto di almeno due meccanismi: l'inattivazione normativo di DnaA (RIDA)^12,13 e dati-dipendente DnaA^ATP idrolisi (DDAH)^{14 ,15}. RIDA sia DDAH promuovere la conversione di DnaA^ATP a DnaA^ADP. Prima di un nuovo ciclo di iniziazione, DnaA^ADP è riattivato per DnaA^ATP alle sequenze specifiche di riattivazione di DnaA (DARS): DARS1 e DARS2^16,17. Cromosomiche dati, DARS1, regionie DARS2 sono non-codificazione e agire in un modo tipo di chaperon per modulare DnaA^ATPl'interconversione di^ADP di /DnaA. Queste regioni, che si trova di fuori l'origine di replicazione, consentono il montaggio di un complesso di DnaA per entrambi l'inattivazione (dati; ¹⁴) o l'attivazione (DARS1 e DARS2; ¹⁷) di DnaA. L'eliminazione di DARS2 in una cella non altera massa raddoppio tempo ma risultati in replica asincrona iniziazione^15,16,18. Tuttavia, DARS2-cellule carenti hanno una palestra costo rispetto ad un altrimenti isogeniche wildtype durante sia concorso di continua crescita in mezzo ricco o durante l'istituzione della colonizzazione dell'intestino del mouse¹⁸. Ciò indica che anche i più piccoli cambiamenti nella concentrazione di asincronia/origine hanno un effetto negativo sul fitness batterica. In e. coli, c'è una pressione selettiva per mantenere di simmetria (cioè, due braccia di lunghezza quasi uguale replica) del cromosoma¹⁹. I dati, DARS1e DARS2 regioni hanno la stessa distanza relativa di oriC in tutti gli e. coli ceppi sequenziati¹⁸, malgrado le grandi variazioni nella dimensione del cromosoma.

Qui, usiamo la regione DARS2 di e. coli come esempio per identificare le posizioni cromosomiche ottimale per la sua funzione. DARS2 è stato inserito il trasposone NKBOR e il risultante NKBOR::DARS2 trasposone successivamente inserito in modo casuale nel genoma di MG1655 ΔDARS2. Abbiamo così generato un insieme di celle, ogni possesso DARS2 collocato in una posizione diversa sul cromosoma. In vitro concorrenza esperimento, dove tutte le celle nell'insieme sono state riunite ed ha Gareggiate contro l'altro durante la crescita continua in LB per un stimato 700 generazioni, è stato effettuato. Il risultato dell'esperimento concorrenza è stato monitorato/determinato tramite Southern blot, gene facile camminare e sequenziamento intero genoma (WGS; Figura 1). Cloni di end-point risolti da gene facile a piedi sono stati caratterizzati mediante citometria a flusso per valutare i parametri del ciclo cellulare. In un'analisi cytometric di flusso, dimensioni della cella, il contenuto di DNA e sincronia di iniziazione può essere misurati per un gran numero di cellule. Durante il flusso cytometry, un flusso di singole cellule passa un fascio di luce della lunghezza d'onda appropriata per eccitare il DNA macchiato, che quindi è contemporaneamente registrato dai fotomoltiplicatori che raccolgono la fluorescenza emessa, una misura del contenuto di DNA, purché il le cellule sono macchiate per il DNA. La luce diffusa diretta è una misura della massa cellulare²⁰.

L'esperimento in vitro concorrenza che vi presentiamo qui è utilizzato per affrontare questioni relative all'importanza della posizione cromosomica e contesto genomico dell'elemento genetico. Il metodo è imparziale e facile da usare.

Protocollo

1. collezione della biblioteca Transposon

Nota: il locus DARS2 cromosomico è stato clonato nel mini Tn 10-base di trasposoni, NKBOR (il pNKBOR) ²¹, conseguente NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR può essere ottenuta online ²². pNKBOR è un vettore basato su R6K suicidio che richiede l'iniziatore della proteina π per replica ²³. Plasmide pJFM1 è quindi in grado di replicare in un ceppo di e. coli (ad es., Dh5α λ pir) contenente una copia cromosomica del gene di pir. Tuttavia, quando pJFM1 si trasforma nel Pir-carenti wildtype MG1655, pJFM1 non può replicare, che portano alla selezione di cloni resistenti alla kanamicina generati da operazioni di inserimento casuale di NKBOR:: DARS2 nel cromosoma batterico. Per semplicità, questi sono denominati DARS2 inserimenti. Vedere la Figura 1 per una presentazione schematica della metodologia.

1. Δ electrocompetent MG1655 preparare DARS2 da attivamente sviluppando celle in brodo Lisogenesi (LB), cresciuta a 37 ° C ²⁴.
2. Electroporate pJFM1 in Δ di electrocompetent MG1655 DARS2, secondo Gonzales et al. ²⁴
   1. aggiungere 1 µ g di pJFM1 (a 1 µ l di acqua) a 40 µ l di electrocompetent Escherichia coli MG1655 Δ DARS2 e trasferire questo composto in una cuvetta pre-refrigerati, sterile divario di 0,2 cm. Inserire la provetta nella camera di elettroporazione. Electroporate alle 18 kV, Ω 500 e 25 µF; la costante di tempo deve essere ~5.0 ms e nessun arco deve verificarsi.
   2. Recuperare rapidamente la sospensione batterica da esso risospendere in 1 mL di brodo LB pre-riscaldato e trasferimento in una provetta da 15 mL.
   3. Lasciare che le celle recuperare incubando in condizioni di crescita aerato a 37 ° C per 30 minuti, senza selezione antibiotica. I batteri su piastre di agar LB completati con kanamicina 50 µ g/mL di piastra e incubare a 37 ° C durante la notte.
3. Contare le colonie dall'elettroporazione: una colonia è considerata uguale a un'inserzione cromosomica trasposone.
   Nota: Le colonie possono essere contati dall'occhio o con un contatore di Colonia. Il numero di colonie è inversamente proporzionale alla distanza media che separa i trasposoni situati nel cromosoma di ogni clone.
4. Aggiungere 1 mL di brodo LB a ciascuna piastra e lavare via tutte le colonie; 1 mL di brodo LB dovrebbe essere sufficiente per lavare via ~ 100.000 colonie. Riutilizzare la stessa 1 mL di brodo LB per aumentare la concentrazione batterica. Piscina tutte le colonie nello stesso tubo 50 mL.
5. Vortex il tubo e congelare il materiale di partenza (t = 0). Per congelarlo, mescolare 1 mL di sospensione cellulare con 1 mL di glicerolo al 50% su ghiaccio. Trasferire le provette per asciugare il ghiaccio per 10 min. Una volta che le culture sono congelate, trasferirli in un congelatore a-80 ° C.
   Nota: Una concentrazione di cellule di un minimo di 50.000 UFC/mL è previsto in questa fase.

2. Esperimento di concorrenza in LB

1. disgelo la libreria trasposone da-80 ° C il ghiaccio. Mix di pipettaggio.
2. Trasferire 100 µ l della biblioteca trasposone a 10 mL di LB in una provetta da 15 mL.
3. Crescere le cellule, aerate agitando continua (250 giri/min), per 8 h a 37 ° C per fase stazionaria (cioè, OD ₆₀₀ = ~ 4.0). Regolare questi parametri alle diverse condizioni di crescita, come desiderato.
4. Propagare la popolazione batterica da continui trasferimenti in mezzo preriscaldato fresco ogni ~ 10 generazioni. A tale scopo trasferire 10 µ l della coltura precedente fase stazionaria a 10 mL di LB fresco e crescente per un altro 8 h per la fase stazionaria (cioè, OD ₆₀₀ = ~ 4.0).
   Nota: Come la densità ottica di inizio e di fine sono gli stessi, una diluizione 1000 volte corrisponde a ~ 10 generazioni di crescita (2 ¹⁰ = 1.024). La popolazione batterica può essere propagata direttamente in mezzo fresco preriscaldata o salvata a 0-4 ° C (su ghiaccio) e propagato il giorno seguente. LB è stata usata qui per garantire accoppiamenti cellulare come molti nel più breve tempo possibile (un tempo di raddoppiamento vicino 22min).
5. Dopo ogni 100 generazioni della concorrenza, salvare cinque campioni di 1 mL a-80 ° C (come descritto al punto 3.3).
6. Se le differenze di fitness tra celle contenenti gli inserimenti trasposone individuali dovrebbero essere piccoli, mantenere la durata del concorso lungo; qui, 700 generazioni (t = 700) sono stati usati.

3. L'analisi del sud della macchia per monitorare la concorrenza esperimento nel tempo

1. preparare la sonda per il Southern blot (sezione 1 kb della NKBOR) eseguendo utilizzando primers specifici per l'amplificazione della polimerasi reazione a catena (PCR): NKBOR_Probe_FW : gatgttggacgagtcggaat e NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt.
   1. Incubare a 98 ° C per 30 s per denaturazione iniziale. Quindi, eseguire 35 cicli a 98 ° C per 10 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 45 s. Per l'estensione finale, utilizzare 72 ° C per 10 min.
      Nota: Il modello per la reazione di PCR è stato un di plasmide purificato pNKBOR ²¹.
   2. Etichetta il risultante frammento PCR con [α - 32P] dATP utilizzando il sistema casuale dell'iniettore, secondo Smith ²⁵.
2. Preparare il DNA cellulare totale secondo Løbner-Olesen e von Freiesleben ²⁶ per t = 0 e selezionato tempo punti fino a t = 700 stimato generazioni della concorrenza.
3. Digerire il DNA cellulare totale con Pvu I, che taglia il NKBOR contenente la regione di interesse una volta solo in un'area non coperta dalla sonda; 1 unità di Pvu posso essere utilizzato completamente digest 1 µ g di DNA substrato.
   Nota: La sonda riconoscerà frammenti contenenti parte del trasposone, insieme a DNA cromosomico di varie lunghezze, a seconda del sito di inserimento.
4. Eseguire una macchia del sud usando un gel di agarosio 0,7% secondo Løbner-Olesen e von Freiesleben ²⁶.

4. Identificazione dei cloni più adatto

1. gene facile di uso a piedi, come descritto da Harrison et al. ²⁷, per identificare i siti di inserimento di DARS2 da singoli cloni (isolati su piastre LB) dopo 700 generazioni stimate della concorrenza; le bande più la macchia del sud, i più isolati sono necessarie per coprire tutti gli inserimenti di trasposoni.
   1. Isolato del DNA genomico per modello di PCR. Diffondere i batteri su una piastra di agar LB contenente kanamicina di 50 µ g/mL e incubare a 37 ° C durante la notte. Crescere colonie singoli pernottamento in libbra di brodo a 37 ° C e successivamente trasferire 20 µ l in 200 µ l di acqua distillata in autoclave (o utilizzare la purificazione del DNA, come descritto al punto 3.2).
      1. Vortex per mescolare. Riscaldare la miscela a 100 ° C per 10 min e centrifugare a massima velocità per 5 min, salvare la cella lysata a-20 ° C per un uso futuro.
   2. Disegnare tre primers nidificati tempri entro il trasposone di scelta (vedere la Figura 2 per una rappresentazione grafica della strategia PCR).
      Nota: Progettazione degli iniettori annidati dovrebbe garantire che nidificato Primer 3 giace più vicino al noto 5 ' fine del trasposone DNA, seguita da Nested Primers 2 e 1. La spaziatura tra nidificati Primer 3 e il 5 ' fine del noto transposon DNA dovrebbe essere sufficiente per un read-through sequenza dal DNA noto al DNA sconosciuto (per trovare il sito di inserzione del trasposone cromosomiche specifiche). Per NKBOR sono stati utilizzati i seguenti primer nidificati: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg e pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg. Primer casuale contenente i siti di riconoscimento degli enzimi di restrizione noti sono utilizzati anche. Per garantire un risultato, si dovrebbe usare almeno due diversi primer casuale. I siti di restrizione per gli enzimi di restrizione (e.g.,Sau 3AI e Hin dIII) devono essere posizionati ai 3 ' fine e preceduta da dieci basi casuale così che 5 ' - NNNNNNNNNNGATC - 3 ' e 5 ' - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 ' sono i primer contenente un sito di 3AI Sau (GATC) e un sito di dIII Hin (AAGCTT), rispettivamente, dove N = A, T, G o C.
   Reazione di PCR di
   3. uso 200 ng di DNA genomico in un 20 µ l. Incubare a 98 ° C per 30 s per la denaturazione iniziale. Eseguire 25 cicli a 98 ° C per 30 s, 50 ° C per 15 s e 72 ° C per 4 min. Per l'estensione finale, utilizzare 72 ° C per 10 min. coppie di primer uso composto da uno degli iniettori casuali e nidificati Primer 1.
   4. Utilizzare coppie di primer composto nidificato 2 Primer e la stessa casuale dell'iniettore dalla seconda amplificazione, usando 1 µ l della sua reazione precedente come modello.
   5. Ripetere il punto 4.1.4 con coppie di primer composto nidificati Primer 3 e la stessa casuale dell'iniettore.
   6. Eseguire i prodotti dalla reazione finale di PCR su un gel di agarosio 1.5% e macchia con bromuro di etidio. Tagliare una banda nella gamma 100-800 bp e isolare il DNA utilizzando qualsiasi commerciale gel del DNA estrazione kit secondo il produttore ' direzione s. Risospendere il DNA in 15 µ l di acqua.
      Nota: attenzione. Il bromuro di etidio è tossico e deve essere maneggiato con cura.
   7. La band isolata nel passaggio precedente (passaggio 4.1.6), con 3 di Primer nidificato come il primer di sequenziamento, utilizzando Sanger di sequenza sequenziamento presso un fornitore commerciale.
2. Eseguire WGS.
   1. Eseguire WGS sul totale il DNA Estratto da selezionati campioni raccolti durante l'esperimento di concorrenza, come descritto da Frimodt-Møller et al. ⁴.
3. Eseguire analisi di sequenziamento.
   1. Align accoppiato-fine legge a 150 Ns contiguo al NKBOR, AF310136.1 1.904 … 2.204 utilizzando Bowtie2 ²⁸ con un intervallo tra le sottostringhe seme (S, 1, 1.15) e un numero massimo di caratteri ambigui (L, 0, 0,9).
   2. Selezionare le letture allineate e poi ri-allineare entrambi Ref MG1655 | NC_000913.3 e NKBOR gb | AF310136 utilizzando blastN ²⁹
   3. assegnare recepimento posizioni di inserimento alle giunzioni MG1655-NKBOR.

5. Citometria a flusso

1. raccogliere campioni per citometria a flusso.
   1. Equilibrio ogni cultura di mantenerlo nella fase di crescita esponenziale per almeno 10 generazioni. Controllare il OD ₆₀₀ e assicurarsi che non supera 0,3.
   2. Raccogliere due tipi di campioni di flusso.
      1. Per RIF-runout, trasferire 1 mL della coltura in una provetta da 15 mL contenente 30 µ l di RIF-CEF (300 µ g/mL rifampicina e cephalexin 36 µ g/mL disciolto in 12,5 mM NaOH). Lasciarlo a 37 ° C per un minimo di 4 ore di agitazione.
         Nota: Rifampicina indirettamente blocca l'avvio della replica di cromosoma consentendo per giri in corso della replica di continuare a terminazione. Cephalexin previene la divisione cellulare, che si traduce in errore di rotazione replica (RIF-eccentricità) e l'accumulo di cellule con cromosomi replicati completamente. Il numero di cromosomi replicati completamente è uguale al numero delle origini al momento del trattamento con rifampicina e cephalexin ²⁰.
      2. Per l'esempio di EXP, trasferimento 1ml di esponenzialmente crescente cultura in una provetta da 1,5 mL su ghiaccio.
2. Fissare le cellule come segue. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 15.000 x g per 5 min a 4 ° C. Risospendere il pellet in 100 µ l di Tris ghiacciata 10 mM pH 7.5 e aggiungere 1 mL di etanolo al 77% ghiacciata. Conservare i campioni a 4 ° C fino all'utilizzo.
3. Macchia le celle come segue. Raccogliere 100-300 µ l di cellule fissate mediante centrifugazione a 15.000 x g per 15 minuti rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 130 µ l di " soluzione di macchiatura del DNA " (90 µ g/mL mithramycin, 20 µ g/mL di bromuro di etidio, 10mm MgCl ₂ e Tris 10 mM pH 7.5). Mettere i campioni sul ghiaccio e al buio; i campioni sono pronti per l'analisi di citometria a flusso dopo 10 min.
   Nota: Altri DNA macchie di bromuro di etidio e mithramycin può anche essere usato ^{30 , 31}.
4. Determinare l'origine al cellulare, la massa di cella relativi e il relativo contenuto di DNA dall'analisi di citometria a flusso.
   1. Esegui flusso cytometry, come descritto in precedenza ³². Eseguire RIF-eccentricità ed EXP-campioni usando il produttore cytometer di flusso ' s istruzioni . Per mithramycin - etidio bromuro-macchiato le cellule e, uso eccitazione lunghezze d'onda 395 e 440 nm e raccogliere la fluorescenza sopra 565 nm.
      1. Per determinare il contenuto di DNA massa e relativo di cella relativo, eseguire gli esempi di EXP per ottenere singolo parametro forward-luce dispersione contro gli istogrammi di numero di cellulare e l'intensità di fluorescenza contro gli istogrammi di numero di cellulare per un minimo di 30.000 eventi corrispondente al segnale cellulare.
      2. Distribuzione luce diffusa diretta uso del singolo parametro per misurare la relativa media cell mass.
         Nota: Luce diffusa diretta è una misura della massa cellulare medio ²⁰.
      3. Distribuzioni di uso fluorescenza intensità singolo parametro per misurare il DNA medio contenuto ²⁰.
      4. Ottenere la concentrazione di DNA come il rapporto di medio contenuto di DNA per la massa media delle celle ²⁰.
   2. Determinare il numero di origini per cella.
      1. Campioni di run RIF-eccentricità per ottenere l'intensità di fluorescenza di singolo-parametro contro cell numeri istogrammi per un minimo di 30.000 eventi corrispondenti al segnale cellulare.
      2. Distribuzioni di uso fluorescenza intensità singolo parametro per determinare il numero di cromosomi in ciascuna cellula ²⁰.
5. Calcolare l'indice di asincronia (Ai).
   1. Calcola l'IA, come descritto da Løbner-Olesen et al. ³², usando le distribuzioni di singolo parametro intensità di fluorescenza dei campioni RIF-eccentricità e l'IA formula = (f3 + f5 + f6 + f7) / (f2 + f4 + f8), dove fx è le cellule di frazione con x numero di cromosomi replicati completamente. Considera iniziazioni asincrona quando A > 0.1.

Risultati

Una macchia del sud è stato fatto per verificare che DARS2 era distribuito in modo casuale in tutto il cromosoma nella libreria trasposone (t = 0) e che i cloni più adatti sarebbero permangono nel tempo. Il Southern blot è stato effettuato su DNA estratto dal pool del trasposone iniziale (t = 0) e ogni 100 stimato fuori 700 generazioni della concorrenza (Figura 3). Qui, il DNA cellulare totale da ogni punto di tempo è stato digerito con Pvu

Discussione

La metodologia utilizzata qui si avvale di tecniche di state-of-the-art di rispondere a una domanda difficile per quanto riguarda la posizione ottimale di genomica di un elemento genetico. L'inserimento casuale dell'elemento genetico (mediata dal trasposone) consente la facile e veloce raccolta di migliaia di cloni, che poi possono essere fatto per competere contro l'altro per selezionare per la posizione ottima dell'elemento genetico studiato (cioè il clone più allenato).

Qui, ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclaved Mili-Q water		None
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm	Thermo Fisher Scientific	P41050
Bio-Rad MicroPulser Electroporation System	Bio-Rad	165-2100
LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780029
LB Agar, powder (Lennox L agar)	Thermo Fisher Scientific	22700025
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	17904
Fisherbrand Plastic Petri Dishes	Fisher Scientific	S33580A
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-53A
Nunc CryoTubes	Sigma-Aldrich	V7634
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL)	Thermo Fisher Scientific	F530S
dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi	PerkinElmer	BLU012H250UC
DECAprime II DNA Labeling Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1455
Spectrophotometer  SF/MBV/03.32	Pharmacia
Hermle Centrifuge    SF/MBV/03.46	Hermle
Ole Dich Centrifuge  SF/MBV/03.29	Ole Dich
Eppendorftubes 1.5 mL	Sigma-Aldrich	T9661
Eppendorftubes 2.0 mL	Sigma-Aldrich	T2795
Sodium Chloride	Merck	6404
96% Ethanol	Sigma-Aldrich	16368
Trizma HCl	Sigma-Aldrich	T-3253
Phenol Ultra Pure	BRL	5509UA
Chloroform	Merck	2445
Ribonuclease A type II A	Sigma-Aldrich	R5000
Sodiumdodecylsulphate (SDS)	Merck	13760
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L 6876
Isopropanol	Sigma-Aldrich	405-7
0.5M Na-EDTA pH 8.0	BRL	5575 UA
Kanamycin sulfate	Sigma-Aldrich	10106801001
PvuI (10 U/µL)	Thermo Fisher Scientific	ER0621
UltraPure Agarose	Thermo Fisher Scientific	16500500
DNA Gel Loading Dye (6X)	Thermo Fisher Scientific	R0611
Tris-Borate-EDTA buffer	Sigma-Aldrich	T4415
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E7637
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	433160
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	71687
Whatman 3MM papers	Sigma-Aldrich	WHA3030931
SSC Buffer 20× Concentrate	Sigma-Aldrich	S6639
Amersham Hybond-N+	GE Healthcare	RPN119B
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F8016
Polyvinylpyrrolidone	Sigma-Aldrich	PVP40
Bovine Serum Albumin - Fraction V	Sigma-Aldrich	85040C
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes	Sigma-Aldrich	D1626
Carestream Kodak  BioMax  light film	Sigma-Aldrich	Z373494
GenElute  Gel Extraction Kit	Sigma-Aldrich	NA1111
GenElute  PCR Clean-Up Kit	Sigma-Aldrich	NA1020
T100  Thermal Cycler	Bio-Rad
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad
Rifampicin	Serva	34514.01
Cephalexin	Sigma-Aldrich	C4895
Mithramycin	Serva	29803.02
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	246964
Apogee A10 instrument	Apogee