Preparación de hidrogeles inyectables basados en quitosano y su aplicación en cultivos celulares 3D

Resumen

Aquí describimos una fácil preparación de hidrogeles inyectables basados en quitosano utilizando química dinámica imina. Se presentan métodos para ajustar la fuerza mecánica de hidrogel y su aplicación en cultivos celulares 3D.

Resumen

El protocolo presenta un método fácil, eficaz y versátil para preparar Hidrogeles basados en chitosán usando química dinámica imina. El hidrogel se prepara mezclando soluciones de glicol quitosano con un gelator de polímero sintetizado benzaldehído terminado y eficientemente se obtienen hidrogeles en varios minutos a temperatura ambiente. Por relaciones diferentes entre glicol quitosano, gelator de polímero y el contenido de agua, se obtienen hidrogeles versátiles con tiempos de congelación diferentes y rigidez. Cuando está dañada, el hidrogel puede recuperar sus apariciones y el módulo, debido a la reversibilidad de los bonos de imina dinámicos como crosslinkages. Esta propiedad la healable permite el hidrogel que inyectable puesto que puede ser auto curado de piezas exprimidas a un hidrogel a granel integral después del proceso de inyección. El hidrogel es también múltiple sensible a muchos estímulos bioactivos debido a Estados de equilibrio diferentes de los bonos de imina dinámico. Este hidrogel fue confirmado como bio-compatibles y células de fibroblasto de ratón de elución de L929 fueron integrados siguientes procedimientos estándar y fácilmente se evaluó la proliferación celular por un proceso de cultivo celular 3D. El hidrogel puede ofrecer una plataforma ajustable para diferentes investigaciones donde es beneficiado un imitador fisiológico de un entorno 3D para las células. Junto con sus propiedades múltiples de respuesta, uno mismo-healable e inyectables, los hidrogeles pueden aplicarse potencialmente como portadores de múltiples drogas y células en futuras aplicaciones de bio-médica.

Introducción

Los hidrogeles son materiales de polímero reticulado con grandes cantidades de agua y propiedades mecánicas, suaves, y se han utilizado en muchas aplicaciones biomédicas^1,2. Los hidrogeles pueden ofrecer un ambiente suave y húmedo, que es muy similar al entorno fisiológico de las células en vivo. Por lo tanto, los hidrogeles se han convertido en uno de los más populares andamios para celular 3D cultura^3,4. Comparado con el cultivo celular 2D de Petri, cultivo celular 3D ha avanzado rápidamente para ofrecer que una matriz extracelular (ECM) mímico el microambiente de las células en contacto con y ensamblar para propósitos de proliferación y diferenciación⁵. Además, los hidrogeles que contienen polímeros naturales podrían ofrecer ambientes bio-compatibles y promover para que las células proliferan y diferencian³. Hidrogeles derivados de polímeros sintéticos se prefieren para sus componentes simples y claras, que excluye influencias complejas como las proteínas de origen animal o virus. Entre todos los candidatos de hidrogel para el cultivo celular 3D, siempre se prefieren los hidrogeles que fácilmente están preparados y tienen una propiedad constante. La facilidad para ajustar propiedades de hidrogel para adaptarse a requisitos de la investigación es importante como bien⁶.

Aquí presentamos una fácil preparación de un hidrogel de glicol basados en quitosano utilizando química dinámica imina, que se convierte en una plataforma versátil de hidrogel para celular 3D cultura⁷. En este método, bien conocido de bio-compatibles de glicol quitosano se utilizan para establecer los marcos de las redes de hidrogel. Sus grupos aminos se reaccionaron con un polietilenglicol benzaldehído terminada como el gelator de polímero para formar la imina dinámica bonos como crosslinkages de hidrogeles⁸. Bonos de imina dinámica pueden formar y descomponer reversible y sensiblemente al entorno, dotando los hidrogeles con reticulado mecánicamente ajustable redes^9,10,11. Debido a su contenido alto de agua, materiales bio-compatibles y fuerzas mecánicas ajustables, el hidrogel se aplica con éxito como un andamio para la elución de L929 células en 3D de la célula cultura^12,13. El protocolo aquí detalles de los procedimientos, incluyendo la síntesis del polímero gelator hidrogel preparación, incrustación de célula y cultivo celular 3D.

El hidrogel también muestra varias otras características debido a su crosslinkages imina dinámico, incluyendo su múltiples sensibles a varios estímulos de bio (ácido/pH, piridoxal derivado de la vitamina B6, la papaína de la proteína, etc.), indicando que podría ser el hidrogel inducida que se descomponen bajo condiciones fisiológicas⁸. El hidrogel es también uno mismo-healable e inyectables, que significa el hidrogel podría ser administrado a través de un método de inyección invasiva mínima y obtener una ventaja en drogas y celulares entregas^14,15. Mediante la adición de aditivos funcionales o gelators del polímero específico prediseñado, el hidrogel es compatible para obtener propiedades específicas como magnético, temperatura, pH de receptivo, etc.^16,17, que podría satisfacer un amplia gama de necesidades de investigación. Esas propiedades revelan capacidad potencial de hidrogel que un inyectable múltiples portadores de drogas y células en investigación bio-médica en vitro y en vivo y aplicaciones.

Protocolo

PRECAUCIÓN: consulte todas las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) antes de su uso. Utilice prácticas de seguridad apropiadas cuando se realizan experimentos de química, incluyendo el uso de una campana y equipo de protección personal (gafas, guantes, bata de laboratorio, etc.). El protocolo requiere célula estándar de manejo de técnicas (esterilización, recuperación de la célula, célula pases, congelación de células, tinción de células, etc.).

1. preparación de hidrogeles

1. síntesis de benzaldehído terminaron di-functionalized polietilenglicol (PEG DF)
   1. previa desecación de PEG polímero
      1. peso 4,00 g PEG (4.000 MW, 1.00 mmol), Transvasar a un matraz de fondo redondo (250 mL) y añadir tolueno (100 mL).
         Nota: Otras clavijas con distintos pesos moleculares puede trabajar para la formación del hidrogel pero conducirá a rigidez diferentes.
      2. Calentar la solución por una pistola de calor (o una placa alrededor de 40 ° C) suavemente para ayudar a disolver los polímeros. Después de disuelven todos los polímeros, utilizar un evaporador para eliminar todos los solventes. Repita este proceso seco y disolver dos veces para hacer la espiga seca polímeros.
         PRECAUCIÓN: Esto debe realizarse en una campana de humos con extremo cuidado. Tolueno es inflamable.
   2. Reacción de terminación benzaldehído de PEG
      1. añadir un agitador magnético y tetrahidrofurano (THF, 100 mL) al matraz y disolver con un agitador de PEG. Añadir 4-carboxybenzaldehyde (0,90 g, 6.0 mmol) y 4-dimethylaminopyridine (0,07 g, 0,6 mmol) secuencialmente a las soluciones para todos los sólidos se disuelven completamente.
      2. Agregar N, N '-diciclohexilcarbodiimida (DCC, 1,25 g, 6.0 mmol) para la solución y añadir un tubo de secado que se llena con anhidro CaCl ₂ al matraz. Mantener la reacción con agitación a temperatura ambiente (~ 20 ° C) para alrededor de 12 h.
   3. Proceso de la post-reacción
      1. filtrar los blancos sólidos generados en la solución de vacío después de que termine la reacción. Verter la solución en éter dietílico frío (500 mL), bajo agitación para precipitar los sólidos blancos. Reunir todos los sólidos blanco, filtro y secar los sólidos en una campana de humos.
      2. Disolver los sólidos blancos en THF otra vez, filtrar cualquier sólidos insolubles blanco, verter la solución en el éter dietílico frío fresco para precipitar los sólidos blancos y secarlo. Repita este proceso dos o tres veces y luego colocar los blancos sólidos en un horno de secado al vacío (20 ° C, 0.1 mbar) para secarlas totalmente. Recoger el polvo blanco como el producto final: benzaldehído terminada DF PEG.
2. Preparación de hidrogeles
   1. pesar diferentes cantidades de DF PEG (0,11 g, 0.028 mmol; 0,22 g, 0.055 mmol; 0,44 g, 0.110 mmol) en un tubo (10 mL), añadir agua desionizada (5,0 mL) y utilizar un vórtice o un agitador magnético para ayudar a disolver el polímero.
   2. Glicol quitosano (0,495 g, 6.18 x 10 ^-3 mmol) en agua desionizada (15,0 mL) en un tubo (50 mL) se disuelven y utilice un vortex durante unos minutos para homogeneizar la solución de quitosano (3% en peso).
   3. Añadir la solución de quitosano de glicol (0,2 mL, 3% en peso) y soluciones de PEG DF (0,2 mL) secuencialmente en un tubo (2.0 mL). Use un vortex para mezclar las soluciones homogéneamente para los hidrogeles forma en varios minutos. Siga las proporciones en la tabla 1 para hidrogeles de fuerzas mecánicas diferentes.
      Nota: Utilice el método de inversión del tubo para determinar si el hidrogel ha formado ya.
3. Análisis de reología
   1. llevar a cabo análisis de reología en un reómetro rotacional con una placa de acero paralelo (diámetro: 20 mm). Para la prueba de congelación, Difunda la solución de quitosano de glicol (0,2 mL, 3% en peso) en una placa inferior. Luego, añadir disoluciones acuosas de PEG DF (0.2 mL, 2% en peso) uniformemente gota a gota sobre la superficie de la solución de quitosano y mezclar rápidamente con una pipeta. Más bajo abajo de la placa superior y comenzar a test
   2. De hidrogel ' prueba de rigidez de s, cortar un hidrogel en un círculo (diámetro: 20 mm) y medir el módulo de almacenamiento (G ') valores versus análisis de frecuencia en la tensión del 1%. G típico ' valores en s rad 6,3 ^{− 1} se enumeran en la tabla 1.
      Nota: Llevar a cabo los análisis reológicos de hidrogel 0.5 h después de la formación del hidrogel para estabilización de vínculo dinámico del hidrogel.
   3. Para el hidrogel ' s uno mismo-healable propiedad prueba, corta un hidrogel para piezas y juntar las piezas para self-heal a una pieza integral. Luego cortar el hidrogel para hacer un círculo (diámetro: 20 mm) y el Reómetro para llevar a cabo el análisis de la reología.

2. 3D cultivo celular en hidrogeles

1. preparación de soluciones de gelificación de hidrogel
   1. pesar DF PEG (0,44 g, 0.11 mmol) en un tubo estéril (4,0 mL), añadir en medios de cultivo celular (RPMI-1640, 2.0 mL) y utilice un vortex o agitador para ayudar a disolver el polímero para obtener la solución de polímero (20% de peso). Cargar la solución en una jeringa (10,0 mL) y luego la esterilización haciéndola pasar por un filtro de retención de bacterias micrones (0,22 μm).
   2. Pesar del glicol quitosano (0,165 g, 2.06 x 10 ^-3 mmol) en un tubo estéril (15,0 mL), añadir en medios de cultivo celular (RPMI-1640, 4,0 mL) y agitar para ayudar a disolver el polímero para obtener la solución de quitosano de glicol (4,0% en peso). Cargar la solución en una jeringa (10,0 mL) y filtrarla con un filtro de 0,22 μm bacterias retentiva.
2. Cultivo de célula en hidrogeles
   PRECAUCIÓN: realizar todos los procedimientos relacionados en una campana de cultivo de tejidos de la célula. Se espera que los conocimientos básicos de la técnica estéril.
   1. Preparación de la suspensión celular
      1. cultura elución de L929 células en RPMI-1640 suplementado con 10% FBS, penicilina 5% (10 mL) en una Petri dish (diámetro 10 cm) e incubar a 37 ° C, 5% CO ₂. Cambiar el medio cada día antes de su uso.
      2. Cosechar las células de la elución de L929 con PBS con tripsina (0,025% de w/v) y EDTA (0.01% w/v), luego centrifugar (70 x g, 5 min) y resuspender las células en el Medio RPMI-1640 (1,0 mL). Realizar el recuento celular mediante operación estándar del tablero de conteo de sangre. Resuspenda las células para regular la concentración de células a ~ 3.75 x 10 ⁶ células/mL.
   2. Encapsulación celular en hidrogeles
      1. mezclar las suspensiones celulares de elución de L929 (0,4 mL, 3.75 x 10 ⁶ células mL ^-1) con solución de quitosano de glicol (0,4 mL) en un tubo (4,0 mL) en el vórtex. Pipetear la solución de quitosano de elución de L929 glicol (0,8 mL) en el centro de un plato de Petri confocal (diámetro 2,0 cm). Pipetear las soluciones PEG DF (0,2 mL) en el mismo plato y pipetee suavemente para mezclar la solución e inducir la formación de hidrogel.
         Nota: Evaluar la formación del hidrogel inclinando la caja Petri.
      2. Para el cultivo de celular directo, añadir cantidades adicionales de medio de cultivo RPMI-1640 (1,0 mL) sobre el hidrogel. Poner los célula encajado los hidrogeles (1,0 mL, 1,5 wt % glicol quitosano, 4,0% en DF PEG, 1,5 × 10 ⁶ células mL ^-1) en una incubadora (37 ° C, 5% CO ₂) y cambiar el medio cada día. Preparar para la proyección de imagen de la célula en día 1, 3, 5 y 7 después de la encapsulación de la célula.
   3. Para el cultivo posterior de celular 3D en hidrogeles después de la inyección, preparar celular cargado hidrogel (1,0 mL, consulte el paso 2.2.2) en una jeringa (10,0 mL, aguja de 48 G). Después de las formas de hidrogel, inyecte lentamente el hidrogel en una placa de Petri para la proyección de imagen confocal. Añadir una cantidad adicional de medios de cultivo (1,0 mL) sobre el hidrogel y cambiarlo todos los días. Poner el plato Petri en una incubadora (37 ° C, 5% CO ₂) y prepararse para luego la proyección de imagen.
      PRECAUCIÓN: Por favor verificar y seguir el protocolo de operación de seguridad de una jeringa de.
3. Análisis de la viabilidad celular
   1. observación Confocal
      1. Enjuague los hidrogeles con PBS (1,0 mL) dos veces. Mancha de los hidrogeles con fluoresceína diacetato (FDA, 0.5 mL, 0.05 mg/mL) y soluciones de (PI, 0.08 mg/mL y 0,5 mL) de yoduro de propidio durante 15 min. Después de la tinción, quite todos los solventes.
      2. Observar los hidrogeles utilizando un microscopio confocal en longitudes de onda de excitación de 488 nm y 543 nm para visualizar en vivo y muerto de las células, respectivamente. Tomar z-pilas a través de cada profundidad de 2 μm de los hidrogeles para validar una distribución uniforme de las células a lo largo de.
         Nota: FDA tiñe células vivas mientras las células muertas de las manchas de la PI.
   2. Degradar el hidrogel (1,0 mL) con ácido acético (HAc, 3% v, 1,0 mL) por 5 min y pipeta en un tubo (4,0 mL). Recoge las células de la centrífuga (70 x g, 5 min) y resuspender las células en el medio de cultivo RPMI-1640 celular (1,0 mL). Realizar la célula cuenta con un tablero de conteo de sangre.

Resultados

Una presentación esquemática de este protocolo en la preparación del hidrogel y su uso como cultivo celular 3D se ofrece en la figura 1. Información de contenidos y relaciones con diversas fuerzas mecánicas el hidrogel se resume en la tabla 1. El hidrogel de uno mismo-healable y propiedad de reología presenta rigidez de hidrogel por módulo de almacenamiento versus frecuencia de prueba en la figura 2. Las imágenes confocales celular y nú...

Discusión

El hidrogel en este protocolo (figura 1) tiene dos componentes principales: el quitosano de glicol polímero natural y una sintética benzaldehído terminaron gelator polímero DF PEG, que son ambos materiales biocompatibles. Síntesis de DF PEG se presentan mediante una reacción de modificación de un solo paso. PEG de peso molecular 4.000 fue elegida en el presente Protocolo en preocupaciones de solubilidad, eficacia de la modificación, así como rigidez de hidrogel. Una serie de hidroge...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycol chitosan	Wako Pure Chemical Industries	39280-86-9	90% degree of deacetylation
4-Carboxybenzaldehyde	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	619-66-9	99%
N, N'-dicyclohexylcarbodiimide	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	538-75-0	99%
Calcium chloride anhydrous	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	10043-52-4	96%
4-dimethylamiopryidine	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	1122-58	99%
Polyethyleneglycol	Sino-pharm Chemical Reagent	5254-43-7	99%
Tetrahydrofuran	Sino-pharm Chemical Reagent	109-99-9	99%
Toluene	Sino-pharm Chemical Reagent	108-88-3	99%
Ethyl ether	Sino-pharm Chemical Reagent	60-29-7	99%
Acetic acid	Sino-pharm Chemical Reagent	64-19-7	99%
Anhydrous CaCl2	Sino-pharm Chemical Reagent	10043-52-4	99%
Fluorescein diacetate	Sigma	596-09-8	99%
Propidium iodide	Sigma	25535-16-4	94%
RPMI-1640 culture media	Gibco
Fetal bovine serum	Gibco
Trypsin-EDTA	Gibco		0.25%
PBS	Solarbio		0.01 M
Penicillin streptomycin solution	Hyclone		10,000 U/mL
Rheometer	TA Instrument		AR-G2
Confocal microscope	Zeiss		710-3channel
L929 Cells	ATCC		NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L
Evaporator	EYELA		N-1100
48 guage needle	ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD		48-guage
Microscope	Leica		DM3000 B
Microscope software	Imaris
Heat gun	Confu		KF-5843
Petri dish	NEST